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       【摘要】 
       目的优化HB-Ⅰa脂质体的工艺处方，提高包封率。方法采用逆相蒸发法制备HB-Ⅰa脂质体，以包封率为指标，通过正交实验对工艺处方进行了优化研究，用HPLC法测定其包封率。用透射电镜扫描观察其外观形态和测定平均粒径。结果最佳的处方比例为卵磷脂：胆固醇：HB-Ⅰa=400∶200∶60，平均包封率为（85.92±0.61）%，平均粒径为11.25μm。结论优化的处方工艺合理，包封率显著提高。
       【关键词】  HBⅠa；脂质体；正交实验；包封率
       
       Optimization of the Preparation and Formulation of  HBⅠa Liposome
       LIU Juan，HU Shuigen,WANG Guohua，KE Qiankun，CAI Dingguo
       1.Research Center of Pharmacy ,PLA 411 Hospital ,Shanghai 200434，China；
       2.School of Pharmacy, Jiangxi   Normal University of Science and Technology, Jiangxi,Nanchang 330013，China；
       3.Jiangxi College of Traditional Chinese Medicine ,Jiangxi, Nanchang 330006,China
       AbstractObjectiveTo optimize the preparation and formulation of HB-Ⅰa liposome and improve the entrapment efficiency. MethodsHB-Ⅰa Liposomes  were prepared  by reversed-phase evaporation .Orthogonal design was adopted to screen the formulation of HB-Ⅰa liposomes on the basis of the entrapment efficiency.The entapment efficiency of HB-Ⅰa was determined by HPLC . The morphology and particle size of the preparation were examined  by transmission electron microscope. ResultsThe optimum formula was PC：CH：HB-Ⅰa=400：200：60.The average encapsulation efficiency was (85.92±0.61)%. The average diameter was 11.25μm.ConclusionThe formulation of HB-Ⅰa is reasonable and can improve the entrapment efficiency.
       Key wordsHBⅠa;  Liposome;   Orthogonal design;   Entrapment efficiency
        HB是从海洋湖沼类软体动物圆背角无齿蚌Anodonta woodiana (Lea)中提取的一组抗肿瘤活性糖蛋白类物质。该活性糖蛋白对7种动物瘤株显示了较强的抗肿瘤活性［1，2］，分子量在1万以上。动物实验表明，仅腹腔注射有效, 口服无效，鉴于HB分子量较大，注射容易产生过敏反应，使得临床应用受到限制。因此将该有效组分制成了脂质体，脂质体口服给药可以保护蛋白质、多肽类药物，避免其在胃肠道降解，并在一定程度上促进药物吸收，具有良好的生物相容性，不会引起副作用。经实验证明，该脂质体口服具有抗肿瘤活性［3］。
        HB有效组分经柱层析分离得到HBⅠa，HBⅠa为一组活性糖蛋白物质，经测定其分子量约为55～67KD，有较强的抗肿瘤活性（HBⅠa HPLC色谱图见图1）。前文［4］已报道过对HBⅠa冻干脂质体粒径及其分布的研究，本文拟对HBⅠa脂质体的工艺处方进行优化，按文献方法［5］制备了HBⅠa脂质体，用HPLC法测定其包封率，通过电镜扫描观察其形态，并用FAM激光粒度仪测定其粒径分布。
       1  仪器与试药
       1.1  仪器
       SENCO 旋转蒸发器 （上海申生科技有限公司），CQ50 超声波清洗器（上海超声波仪器厂），ZK401 低温高速离心机 (HERMLE), 离心管（HITACHI S303922A）， FA1604S电子天平（上海天平仪器厂），岛津SPD10A 检测器，岛津LC6A泵，透射电镜仪（TESCAN  复旦大学）, FAM激光粒度仪(上海理工大学)。
       1.2  试药
       胆固醇（cholesterol, CH, 上海新兴化工试剂研究所，批号030318），卵磷脂（phosphatidylcholine, PC, Serva进口分装，上海伯奥生物科技公司，批号031103）, HBⅠa（自制）， HBSPⅠ对照品（自制,纯度＞90%，MW=62KD ）
       2  方法与结果
       2.1  正交实验设计因素和水平的确定根据预实验的结果，选取A  （PC用量），B （CH用量） ，C（ HB-Ⅰa用量）3个考察因素，每个因素选3个水平。采用L9(34)设计，因素水平见表1。表1  因素和水平（略）
       2.2  HBⅠa脂质体的制备
       采用逆相蒸发法制备，取处方量的PC和CH溶于乙醚10 ml；另取HBⅠa溶于4 ml生理盐水中，将两溶液混合于茄形瓶中，超声振荡2 min（功率50 W，每振荡0.5 min，间歇0.5  min）；40℃下减压旋转蒸发除去乙醚，至成黏稠溶液后再加入6 ml生理盐水，超声振荡2 min（每振荡0.5 min，间歇0.5 min）; 继续常压旋转蒸发1 h，得HBⅠa脂质体混悬乳浊液。
       2.3  HPLC法测定HB- Ⅰa 脂质体包封率
       2.3.1  色谱条件 
       色谱柱：TSKGEL  G3000SW (7.5 mm×300 mm,Column No ：G0534)； 流动相15 mM NaCl磷酸盐缓冲液(pH=7.4) ；流速1.0 ml·min-1；柱温25 ℃；检测波长280 nm。
       2.3.2  HBSPⅠ对照品溶液的制备
       精密称定HBSPⅠ对照品25 mg，置25 ml量瓶中，加重蒸馏水溶解并稀释至刻度，摇匀，备用（ HPLC色谱图见图2）。
       2.3.3  样品溶液的制备
       取HBⅠa脂质体混悬乳浊液5 ml，置于离心管中，在低温高速离心机上，以20 000 r·min-1在4℃下离心2 h。取上清液稀释到适当浓度作为样品溶液。
       2.3.4  标准曲线的绘制
       精密吸取1 mg·min-1HBSPⅠ对照品溶液0.5，1，2，3，4，5 ml分别置于5ml容量瓶中，用重蒸馏水稀释至刻度，配制成浓度分别为0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1 mg·min-1的系列溶液，取20 μl进样。以对照品峰面积与浓度作标准曲线。结果表明HBSPⅠ对照品溶液在0.1～1 mg·min-1浓度范围线性良好，回归方程为：Y =34450X-1 730.2，r =0.997 9。
       2.3.5  包封率测定
       精密吸取各样品溶液20μl，注入液相色谱仪，（色谱图见图3）。根据HBⅠa标准曲线计算样品浓度，并根据公式计算脂质体包封率。
       2.4  正交实验结果分析结果见表2～3。表2  L9(34)正交实验结果（略）表3  HBⅠa脂质体包封率方差分析（略）
        方差分析表明：影响因素为A＞C＞B。因素A（PC）对实验结果有显著性影响。直观分析表明：以HPLC法测定的包封率为指标，最佳处方工艺为A3B3C3, 即处方比例为PC∶CH∶HB-Ⅰa=400∶200∶60 。
        按上述最佳工艺处方制备3批样品，平均包封率为（85.92±0.61）%，重现性良好，工艺稳定。结果见表4。表4   3批样品包封率测定结果(略)
       2.5  HB-Ⅰa脂质体的形态 HB-Ⅰa脂质体为黄色乳状混悬液。在透射电镜下，可以清楚的看到脂质体的囊泡状结构,多为球形或类球形，也有2个或3个发生粘连呈长条形，多数为大小单室脂质体。见图5。
       2.6  HB-Ⅰa脂质体的粒径与粒度分布取HB-Ⅰa脂质体混悬液1 ml ,用重蒸馏水稀释后滴入激光粒度仪中测定HB-Ⅰa脂质体的粒径与粒度分布。见图6。
       3  讨论
       3.1  逆相蒸发法是制备水溶性药物、大分子生物活性物质如各种抗生素、胰岛素免疫球蛋白、碱性磷脂酶、核酸等脂质体常用的方法之一，适用于包裹。HB-Ⅰa为大分子糖蛋白，因此本实验采用逆相蒸发法来制备HB-Ⅰa脂质体，预实验中考察过不同的包封温度（20，30，40℃）对包封率的影响，结果发现温度越高，包封率越高，这可能和温度越高，膜的柔性越好，越有利于形成脂质体膜有关。
       3.2  本实验曾采用凯式定氮法（《中国药典》2000版Ⅱ部附录ⅦD氮测定法）实验并计算HB-Ⅰa脂质体包封率。结果凯式定氮和HPLC两种方法测得的包封率结果基本一致，但凯式定氮法较为繁琐，测定时间长。HPLC法则更快速、方便、准确。
       3.3  脂质体包封率测定方法有离心法、柱分离法、超滤法等，但由于HB-Ⅰa分子量较大，用柱分离法、超滤法很难分开游离药与脂质体，故选用离心法分离测定包封率。
       3.4  药理实验表明，游离的HB糖蛋白口服无抗肿瘤活性，将其制成HB脂质体后才显示了抗肿瘤活性。其原因可能是，口服脂质体，与非胃肠道应用不同，可使细胞因子作用于Payer"s结，通过Mell细胞的吞饮吸收，从而使一部分药物避免了首过作用和胃肠道酶的降解，被肿瘤细胞所摄取。此外，脂质体作为抗癌药物载体具有能增加与癌细胞的亲和力，克服耐药性，增加药物被癌细胞的摄取量，降低用药剂量，提高疗效，降低毒副作用的特点。
       
       致谢：本文得到了上海医药工业研究院谢葆源教授的指导，谨致谢意！
       【参考文献】
         　　［1］杜罗喜，严惠芳，胡水根，等. HB有效成分抗肿瘤作用的研究［J］.中国海洋药物,1993,12(1)：10.
       
       ［2］杜罗喜,戴静芝, 严惠芳,等. HB有效成分对巨噬细胞功能的影响［J］.中国海洋药物,1993,12(3)：14.
       
       ［3］胡水根, 严惠芳,王奕军,等. 园背角无齿蚌有效成分脂质体抗小鼠肿瘤实验研究［J］.中国海洋药物,2003,94(4)：23.
       
       ［4］苏树强,华泽钊,丁志华,等. HB-Ⅰa冻干脂质体粒径及其分布的研究［J］.中国医药工业杂志,2004,35(3):154.
       
       ［5］胡水根,朱国平,吴萍萍,等.河蚌脂质体的制备方法及其应用［P］.中国发明专利公报，CN1329885A.20020109.