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       【摘要】 
       目的比较大黄结合蒽醌、游离蒽醌致泻作用的强度并探讨其相关机制。方法通过灌服高浓度的奶粉溶液以营造高营养性环境，在此基础上考察了大黄结合蒽醌及游离蒽醌对小鼠的致泻作用；并运用析因设计分析了奶粉在这些致泻作用中的作用，同时还考察了大黄结合蒽醌及其游离蒽醌体外对胃蛋白酶活性的影响。结果大黄游离蒽醌500，1 000 mg/kg均可使小鼠胃内容物和小肠内容物显著增加；大黄结合蒽醌500，1 000 mg/kg也可显著增加小鼠小肠内容的重量，但对小鼠胃内容重量的影响作用较弱；各药物组均可显著增加小鼠各肠段内的蛋白质浓度。析因设计的实验结果显示，无论是大黄游离蒽醌或是结合蒽醌均可显著增加正常小鼠（未加用奶粉）的胃、小肠及全胃肠道的内容物及蛋白质的含量，并可显著降低小鼠小肠、结肠Cl-浓度和升高小鼠结肠K+浓度；奶粉本身也具有与大黄蒽醌类似的作用，与之合用可增强大黄蒽醌的作用。体外实验结果显示，无论是大黄游离蒽醌或是结合型蒽醌对胃蛋白酶的活性均无明显影响。结论大黄游离蒽醌和结合蒽醌均具有显著的致泻作用；其机理可能是通过刺激胃肠道分泌、增加胃肠道内蛋白质浓度而产生容积性导泻。
       【关键词】  大黄结合蒽醌 大黄游离蒽醌 胃 小肠 结肠
       The Inducing Diarrhea Effects and its Mechanisms of Anthraquinon from Rheum palmatum L.
       TANG Daxuan，TAN Zhenghuai，LIANG  Yuanyuan，CHENG Lei，HUANG Li
       1.Sichuan Institute of Chinese Materia Medica, Chengdu 610041，China； 
       2.Yunnan Dali College, Yunnan  671000，China
       Abstract：ObjectiveTo compare the efficiency and mechanisms of diarrhea induced by anthraquinon and glycosides of anthraquinone from Rheum Palmatum L. in mice. MethodsThe lapactic effects of anthraquinon and glycosides of anthraquinone from Rheum Palmatum L. were studied in the mice which were given high concentration of powdered milk solution to induced supernutrition, and the effects of these drugs on the activity of pepsin were measured in vitro. The effect of milk on the lapactic action of anthraquinon and glycosides of anthraquinone were analyzed using the factorial design. ResultsThe anthraquinone of Rheum palmatum L. 500，1 000 mg/kg significantly increased the remnant in the gastric and small intestine in mice, and the glycosides of anthraquinone from Rheum Palmatum L. 500，1 000 mg/kg also significantly increased remnant in small intestine in mice. All these drugs could increase the concentration of protein in the gut in mice. The results of the factorical design showed that the anthraquinone or glycosides of anthraquinone of Rheum palmatum L. were able to remarkably increase the remnant and protein concentration in stomach, small intestine and all of gastrointestinal tract, reduce the concentration of Cl- in small intestine and colon, increase the concentration of K+ in colon in normal mice. Milk had the similar effect and could enhance the action of anthraquinone of Rheum palmatum L. In vitro, anthraquinone or glycosides of anthraquinone from Rheum palmatum L. had no action on the activity of pepsin. ConclusionThese results indicated that antharquinone or glycosides of anthraquinone from Rheum palmatum L. can induce diarrhea in mice. These actions may due to that anthraquinone can increase the secretion of protein in gut.
       Key words：Anthraquinone from Rheum Palmatum L.(ARP);  Glycosides of anthraquinone from Rheum Palmatum L .(GARP);  Stomach;  Small intestine;  Colon
        大黄为蓼科植物掌叶大黄Rheum palmatum L.药用大黄Rheum offcinale Baill.和唐古特大黄Rheum tangguticum Maxim.ex Balf.的根和根茎。味苦，性寒。归脾、胃、大肠、肝、胆经。具泻下攻积、调中化食、平肝降气、利胆退黄、清热解毒、泻火凉血、止血活血、利水消肿等功效。现代广泛应用于消化系统疾病、急慢性肾功能衰竭、出血性疾病、急性感染、急性中毒抢救以及糖尿病肾病的防治等［1］，显示大黄在临床中的用途广泛。以往认为大黄的致泻成分主要是其结合型蒽醌，其作用部位主要在大肠，认为其作用机理与结合型蒽醌刺激大肠黏膜下及肠壁肌层内的神经丛显著促进横结肠和降结肠蠕动有关［2］。我们在前期的研究中发现大黄游离蒽醌在体外对豚鼠结肠的作用明显强于结合型蒽醌，同时也有文献报道认为大黄及其有效成分蒽醌类物质可显著抑制胰蛋白酶和胰脂肪酶等［3］，那么大黄的泻下作用是否与其抑制肠道内的蛋白酶及脂肪酶活性，减少脂肪及蛋白质的吸收，在肠道中产生高渗性环境有关？而起主要作用的是结合型蒽醌还是游离型蒽醌？为探讨这些问题，我们通过灌服高浓度的奶粉溶液以营造高营养性环境，在此基础上探讨了大黄结合蒽醌及游离蒽醌的致泻作用及其机理。
       1  材料和方法
       1.1  药物大黄结合蒽醌（Glycosides of Anthraquinone from Rheum palmatum L.，以下简称GARP）：大黄经水煮提取后再用大孔树脂进行分离纯化，其大黄蒽醌主要为结合型，其纯度为36.5%；大黄游离蒽醌（Anthraquinone from Rheum palmatum L.，以下简称ARP）, 其游离蒽醌含量为85.6%药, 以上实验用药均由四川省中药研究所药化室易进海博士提供。临用前用蒸馏水或40%奶粉溶液配制成所需浓度的混悬液备用。通便灵胶囊，0.25 g/粒，通化白山制药五厂生产，批号20020601-0249，临用前用蒸馏水配成所需浓度备用。伊利全脂甜奶粉，内蒙古伊利实业集团股份有限公司，批号8712880。临用前用蒸馏水配成所需浓度备用。
       1.2  试剂总蛋白（TP）检测试剂盒，批号 0106091；甘油三酯（TG）检测试剂盒，批号 0106061，均由四川省迈克科技股份有限公司提供。HC-988 A标准液，批号20060227；HC-988 B标准液，批号 20041129，均由深圳市航创医疗设备有限公司提供。Pepsin,1：3000，Sigma 产品。
       1.3  动物SPF级昆明种小鼠，雌雄各半，生产合格证号为SCXK（川2005-19），四川省中药研究所实验动物中心提供。
       1.4  仪器比色计，UV-730半自动生化分析仪，日本岛津产；电解质分析仪HC9883，深圳市航创医疗设备有限公司产。
       1.5  方法
       1.5.1  结合蒽醌和游离蒽醌对小鼠致泻作用 根据文献［3］略有改动，取20～22 g小鼠68只，雌雄各半，禁食不禁水24 h后，将动物随机分为6组，即奶粉组、奶粉+结合蒽醌500 mg/kg、奶粉+结合蒽醌1 000 mg/kg，奶粉+游离蒽醌500 mg/kg、奶粉+游离蒽醌1 000 mg/kg及奶粉+阳性药物组，实验当天分别灌服药物或等容量40%奶粉液（1.0 ml/只），药后50 min处死小鼠，取胃、小肠和结肠称取全重，再分别用2ml生理盐水洗净胃、小肠和结肠的内容物，用滤纸吸去水分后称重（各器官净重），各器官的全重减各器官的净重即为内容物重。收集洗出的内容物，离心，取上清液分别测定其总蛋白及小肠内容物中的TG含量。
       1.5.2  析因设计探讨奶粉对大黄结合蒽醌及游离蒽醌致泻作用的影响取20～25 g小鼠60只，雌雄各半，禁食不禁水24 h后，将动物随机分为6组，即正常对照组(蒸馏水)、奶粉组、结合蒽醌1 000 mg/kg、游离蒽醌1 000 mg/kg，奶粉+结合蒽醌1 000 mg/kg及奶粉+游离蒽醌1 000 mg/kg、实验当天分别灌服药物或等容量40%奶粉液或等容量蒸馏水（1.0 ml/只），药后30 min处死小鼠，取出胃、小肠和结肠称取全重，再分别用2 ml生理盐水洗净胃、小肠和结肠的内容物，用滤纸吸去水分后称重（各器官净重），全重减净重即为内容物重。收集洗出的内容物，离心，取上清夜分别测定总蛋白，测定小肠内容物中和结肠内容物中的K+,Na+，Cl-含量及小肠内容物中TG含量。
       1.5.3  结合蒽醌和游离蒽醌体外对胃蛋白酶的影响采用Mett法［4］制备蛋白管，即将内径1～2 mm粗细均匀的毛细管截成5 cm长，用鸡蛋1枚，取出蛋清，充分摇匀后用纱布过滤，将上述毛细管利用虹吸作用灌满蛋清（内无气泡），然后放在85℃热水中使蛋白凝固，待冷却后，取出毛细管用蜡将蛋白管两端封闭，储冰箱中备用。实验时取2%胃蛋白酶0. 1 mol/L盐酸溶液5 ml，放入一次性试管中，各药物组分别加入各受试药液100 μl（二甲基亚砜配制），正常组加入二甲基亚砜100 μl，摇匀后，放进上述蛋白毛细管两根（先折去固封的蜡端），密封，37℃孵育24 h，测定毛细管两端透明部分的长度（cm）,将两端的长度相加即为被消化的蛋白量。
       1.6  统计分析计量资料采用 ±s表示，采用方差分析和t检验。分析协同作用时采用方差分析。
       2  结果
       2.1  大黄结合蒽醌和游离蒽醌对小鼠致泻作用从表1可见，大黄游离蒽醌500，1 000 mg/kg及通便灵1 000 mg/kg均可使小鼠胃内容物和小肠内容物显著增加，与奶粉对照组比较有统计学差异（P<0.05或P<0.01）；大黄结合蒽醌500，1 000 mg/kg可显著增加小鼠小肠内容的重量，与对照组比较有统计学差异（P<0.05）；但对小鼠胃内容重量的影响作用较弱，与对照组比较无统计学差异。
       2.2  大黄结合蒽醌和游离蒽醌对小鼠胃、小肠及结肠内容物总蛋白含量的影响从表2可见，大黄游离蒽醌、结合蒽醌及通便灵均可使小鼠胃、小肠及结肠中的蛋白质含量显著增加，与奶粉对照组比较有统计学差异（P<0.05或P<0.01）；且大黄游离蒽醌的作用显著强于大黄结合蒽醌。表1  大黄结合蒽醌和游离蒽醌对小鼠各段胃肠道内容物重的影响（略）表2  大黄结合蒽醌和游离蒽醌对小鼠胃、小肠及结肠内容物总蛋白含量的影响（略）
       
       2.3  灌服奶粉对大黄结合蒽醌和游离蒽醌增加小鼠各段胃肠道内容物重量的影响从表3可见，奶粉组、大黄结合蒽醌1 000 mg/kg及大黄游离蒽醌1 000 mg/kg均可显著增加小鼠胃内容物、小肠内容物及所有胃肠道的内容物重量，与对照组比较有统计学差异（P<0.01）；大黄游离蒽醌1 000 mg/kg还可显著增加小鼠结肠内容物重量，与对照组比较有统计学差异（P<0.01）；大黄结合蒽醌1 000 mg/kg或大黄游离蒽醌1 000 mg/kg与奶粉合用均可显著增加小鼠小肠内容物、结肠内容物重量及所有胃肠道的内容物重量（P<0.01），与奶粉组比较有统计学差异（P<0.05或P<0.01）。表3  灌服奶粉对大黄结合蒽醌和游离蒽醌增加小鼠各段胃肠道内容物重量的影响（略）
       
       2.4  灌服奶粉对大黄结合蒽醌和游离蒽醌增加小鼠各段胃肠道蛋白质浓度的影响从表4可见，奶粉组、大黄结合蒽醌1 000 mg/kg及大黄游离蒽醌1 000 mg/kg均可显著增加小鼠胃、小肠、结肠及全胃肠道内蛋白质水平，与对照组比较有统计学差异（P<0.01）；大黄结合蒽醌1 000 mg/kg或大黄游离蒽醌1 000 mg/kg与奶粉合用均可显著增加小鼠胃、小肠及结肠及全胃肠道内蛋白质水平，与奶粉组比较有统计学差异（P<0.01）。表4  灌服奶粉对大黄结合蒽醌和游离蒽醌增加小鼠各段胃肠道蛋白质浓度的影响（略）
       2.5  灌服奶粉对大黄结合蒽醌和游离蒽醌调控小鼠小肠TG及K+，Na+，Cl- 浓度的影响从表5可见，奶粉组、大黄结合蒽醌1 000 mg/kg及大黄游离蒽醌1 000 mg/kg均可显著降低小鼠小肠内氯离子水平，与对照组比较有统计学差异（P<0.01）；大黄结合蒽醌1 000 mg/kg或大黄游离蒽醌1 000 mg/kg与奶粉合用均可显著降低小鼠小肠内氯离子水平，与奶粉组比较有统计学差异（P<0.01）。但各药物或奶粉均对小鼠小肠内的钾离子水平无明显影响。表5  灌服奶粉对大黄结合蒽醌和游离蒽醌调控小鼠小肠TG及K+，Na+，Cl-浓度的影响（略）
       
       2.6  灌服奶粉对结合蒽醌和游离蒽醌调控小鼠结肠K+，Na+，Cl- 含量的影响从表6可见，奶粉组、大黄结合蒽醌1 000 mg/kg及大黄游离蒽醌1 000 mg/kg均可显著降低小鼠结肠内氯离子水平，增加小鼠结肠内钾离子水平，与对照组比较有统计学差异（P<0.01）；大黄结合蒽醌1 000 mg/kg与奶粉合用 可进一步降低小鼠结肠内氯离子水平，增加小鼠结肠内钾离子水平，与奶粉组比较有统计学差异（P<0.01）。表6  灌服奶粉对结合蒽醌和游离蒽醌调控小鼠结肠K+，Na+、CI-含量的影响（略）
       2.7  大黄结合蒽醌和游离蒽醌对胃蛋白酶活性的影响从表7可见，大黄结合蒽醌和游离蒽醌体外对胃蛋白酶均无明显影响。
       表7 大黄结合蒽醌和游离蒽醌对胃蛋白酶活性的影响（略）
       3  讨论
        大黄含有约1.01%～5.19%蒽醌衍生物,其中以结合型为主,主要有番泻苷(sennoside)A，B，C，D，E，F等，也含有少许游离蒽醌，如大黄酸、大黄素及大黄酚等［1］。以往认为大黄的致泻成分为番泻苷，其次为芦荟大黄素和大黄酸。大黄素、大黄酚和大黄素甲醚的致泻作用很弱。番泻苷须经肠道细菌代谢为大黄酸蒽酮后才发挥泻下作用，主要是其结合型蒽醌，其作用部位主要在大肠，认为其作用机理是：大黄口服后，通过小肠时结合型的蒽醌大部分未经吸收直接抵达大肠，在大肠经细菌酶作用切去糖的部分生成苷元，在酶的作用下，还原成活性成分大黄酸蒽酮或大黄酸蒽酮-8-葡萄糖苷，刺激大肠黏膜下及肠壁肌层内的神经丛，显著促进横结肠和降结肠蠕动，给予氯霉素后，大黄酸蒽酮的生成被抑制，泻下作用减弱［5，6］。但是，本研究发现，无论是大黄结合蒽醌或是大黄游离蒽醌既可增加小鼠胃内容物、又可显著增加其小肠和结肠的内容物，显然大黄结合蒽醌或大黄游离蒽醌的作用点主要在小肠和胃，其次为结肠，可见大黄蒽醌并不需要在大肠中进行转化就可以直接起作用。在研究中还发现，伴随胃、肠腔内容物的增加是其蛋白质显著增加和电解质发生显著改变，可见其胃肠内容物增加主要是由于肠道内蛋白质增加致肠腔内渗透压升高；肠腔内蛋白质增加可能与以下两方面的因素有关：一是胃蛋白酶活性降低致蛋白分解减少而减少蛋白质的吸收；另一方面可能由于胃肠道的黏膜受到刺激增加向肠腔中分泌某些蛋白质物质。从本实验结果可以看出，大黄蒽醌增加胃肠道中蛋白质含量的作用主要是通过刺激胃肠道黏膜而增加其分泌功能，似与其抑制胃蛋白酶活性作用无关；也有认为大黄的致泻作用与其抑制胃肠道内Na+,K+-ATP酶活性有关［6］，由于本实验没有测定该酶活性，所以不能肯定该作用在大黄致泻作用中的地位；令人感兴趣的是：大黄所引起Na+，K+及Cl-浓度的改变与奶粉的作用相似，可见小肠与结肠内的Na+，K+及Cl-浓度的改变可能是由于肠道内容物增加致其吸收功能代偿性增加所致，其作用机理还有待进一步研究。
       【参考文献】
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