文章标题 全文   多个检索词，请用空格间隔。

       【摘要】 
       目的探讨大鼠大脑海马立体定向注射β淀粉样蛋白140对血清TNFα和IL1β含量的影响及通络救脑口服液对其干预作用。方法140只SpragueDawley（SD）大鼠随机分为空白对照组、假手术组、阴性对照组、阳性对照组、实验组（12，24，48 mg·kg-1·d-1）共7组。采用大脑海马立体定向注射β淀粉样蛋白140诱导Alzheimer"s病动物模型后，药物干预4周，第5周应用双抗夹心酶联免疫吸附测定检测TNFα和IL1β含量。结果模型组TNFα，IL1β含量分别为（120.97±7.32）和（88.54±4.07），TNFα和IL1β含量显著多于假手术组（TNFα为85.43±6.55 ，IL1β为68.29±4.37，P＜0.01），表明模型组TNFα和IL1β含量升高；与模型组比较，盐酸多萘哌齐组（TNFα为106.86±7.09；IL1β为1.80±0.23）、通络救脑口服液12，24，48 mg·kg-1·d-1剂量组（TNFα分别为100.08±9.29、99.97±6.09和85.90±4.40；IL1β分别为（77.56±6.97），（77.85±3.81）和（67.87±2.38）TNFα和IL1β含量升高显著减少。结论 大鼠海马注射β淀粉样蛋白1～40后大鼠血清TNFα和IL1β含量明显增高，通络救脑口服液可以降低血清TNFα和IL1β的含量，从而发挥其抗老年性痴呆的作用。
       【关键词】  炎症 阿尔茨海默病 通络救脑口服液 酶联免疫吸附测定
       Expression of TNFa and ILβ1 in Aβ140 Induced AD in Rats and the Effect of TLJN Oral Solution
       ZHANG Xiaojie,  NIU Yingcai，ZHOU Li，LI Pengtao
       1.Qiqihar Medical College, Qiqihar 161042,China;
       2.Beijing University of Traditional Chinese Medicine, Beijing 100102，China
       Abstract：ObjectiveTo observe the effect of TLJN Oral Solution on express level of TNFα and IL1β in serum of experimental AD rats in vivo. Methods140 SD rats were enrolled in the study, and they were equally randomly divided into blank control group ，sham control group，negative control group，positive control group and experiment group(48，24，12 mg·kg-1·d-1).A rat model of AD was induced by amyloidβ140 sterotaxis injection into the bilateral Hippocampus. All rats were sacrificed at the 5 th week after treatment for 4 weeks. TNFα and IL1β protein levels in serum were determined using ELISA.ResultsProtein levels of TNFα and IL1β in serum were raised in model groups, in which TNFα were 85.43±6.55 and IL-1β were 68.29±4.37, compared with the sham group(TNFα were 85.43±6.55 ，IL1β were 68.29±4.37），P＜0.01. In experiment groups ,which TNFα respectively were (100.08±9.29），（99.97±6.09） and （85.90±4.40) ，and IL1β respectively were (77.56±6.97），（77.85±3.81）and（67.87±2.38），protein levels of TNFα and IL1β were reduced compared with the model group (P＜0.01).ConclusionTLJN Oral Solution can reduce TNFα and IL1β content in serum.
       Key words:Inflammation；  Alzheimer"s disease；  TLJN Oral Solution；  Enzyme linked immunosorbent assay
        
       近年来许多研究资料表明，免疫炎症机制在AD发生发展中起着至关重要的作用［1］。目前人们普遍公认，炎前细胞因子参与AD的神经病理损伤过程。在阿尔茨海默病患者死后的尸检中发现，其脑内老年斑（senile plaques,sp）的周围有大量被激活的小胶质细胞和星性胶质细胞。体外培养的结果也充分表明，SP的主要成分β淀粉样肽可通过激活胶质细胞，使其产生并释放炎性细胞因子，从而引起毒性反应，细胞因子促进β淀粉样蛋白在AD脑内神经炎性斑中沉积，在AD发病中起着重要作用［2］。然而，相关动物实验并不够充分，本研究采用大脑海马立体定向注射Aβ140的方法建立AD大鼠模型，并用通络救脑口服液进行药物干预，观察通络救脑口服液对AD样大鼠血清细胞因子水平的影响，以探讨通络救脑口服液对AD可能的防治作用。
       1  材料与方法
       1.1  药物通络救脑口服液，由北京中医药大学中药学院制备。盐酸多奈哌齐片由法国PFIZER PGM公司制造，产品批号5136903。Aβ140为北京中杉金桥生物技术有限公司产品。Aβ140使用前用无菌生理盐水稀释成10 μg·μl-1，37℃孵育1周，使其变为聚集状态的Aβ。
       1.2  动物健康雄性清洁级SD大鼠140只购于北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证编号SCXK（京）20020003，鼠龄8～12周，体重（280±10）g，经适应性饲养1周，完全随机分为7组：空白对照组、假手术对照组、阴性对照组、阳性对照组和3个剂量实验组，每组20只。
       1.3   试剂大鼠白介素
       1β定量EIA试剂盒和大鼠TNFα定量EIA试剂盒均由上海森雄科技实业有限公司提供。
       1.4  仪器 
       Safire2 全波长多功能酶标仪为瑞士TECAN集团公司产品。PURELAB PLUS超纯水系统为美国波尔公司产品，WELL wash 4MK2洗板机为芬兰Labsystems公司产品。
       1.5   方法
       1.5.1  动物模型的制作［3］
       实验大鼠1%戊巴比妥钠（40 mg/kg）麻醉后，立体定位仪固定头部，备皮消毒，沿颅顶中线作2  cm切口，分离骨膜使头骨暴露，于前囟向后3.0 mm，中线左右各旁开2.2 mm，用牙科钻打开颅骨，垂直进微量进样器针2.8 mm，将1 μl溶液缓慢注入，注射时间为5 nim，留针5 min，阴性对照组、阳性对照组和各剂量实验组左右侧海马各注射1 μl Aβ140(10 μg)溶液，假手术对照组注射1 μl生理盐水。
       1.5.2  给药方法
       造模后3 d开始给药，根据人和动物按体表面积折算的等效剂量。阳性对照组按0.33 mg·kg-1·d-1，1次/d灌胃，各实验组分别按48，24，12 mg·kg-1·d-1给药。其余3组给等体积生理盐水，共4周。行为学测试结束后处死取材。
       1.5.3  TNFα和IL1β的检测 
       行为学测试结束后摘眼球取血4～6 ml，4℃ 4000 r·min-1离心，取血清，采用双抗体夹心ABCELISA法，测定大鼠血清TNFα和IL1β的含量，具体步骤按试剂盒说明书进行，酶标仪492 nm处测A值，绘标准曲线，求算样品中TNFα和IL1β浓度。
       1.5.4  统计学方法
       数据用±s表示，统计分析采用完全随机设计资料的方差分析，组间两两比较运用LSDt检验。
       2  结果
       2.1  通络救脑口服液对TNFα和IL1β的影响结果见表1。表1  通络救脑口服液对拟AD大鼠血清TNFα和IL1β含量的影响(略)
        从表1可以看出，模型组大鼠血清TNFα和IL1β含量较假手术组大鼠显著增高（P＜0.01)，通络救脑口服液各剂量（48，24，12 mg/kg）和盐酸多奈哌齐均能使模型大鼠血清TNFα和IL-1β显著降低（P＜0.01），其中通络救脑口服液高剂量组比低剂量组和中剂量组显著。与盐酸多奈哌齐组比较，通络救脑口服液高剂量组大鼠的血清TNFα和IL-1β显著降低（P＜0.05），表明通络救脑口服液和盐酸多奈哌齐均可对AD模型大鼠血清TNFα和IL1β产生明显影响，其中高剂量组作用明显强于盐酸多奈哌齐组。
       3  讨论
        阿尔兹海默病是一种原发性中枢神经系统退行性疾病，老年斑是AD最基本的病理改变之一，它是由细胞外β淀粉样蛋白（βAP）的沉积而形成［4］。在已知的AD的致病因素中，βAP是致病的关键因素之一。海马与学习记忆特别是近期记忆功能密切相关，在AD中它是最易受累的脑区之一，因而AD有“海马痴呆”之称。海马具有高度有序化的板层结构，且各种神经组织相对独立分布，选用海马定位损伤是复制AD动物模型较为理想的途径［5］，本实验通过大鼠大脑海马组织立体定位注射凝聚状态Aβ建立AD局部炎症病理模型并观察通络救脑口服液对其干预作用，以探讨其抗Aβ神经毒性的分子机制，为抗炎中药复方在AD中的临床应用提供依据。
        研究资料表明，AD患者脑内持续存在着慢性炎症反应，并可能是其他病理特征形成和发展的诱发因素，流行病学研究表明长期服用非甾体类抗炎药物的人群患AD的危险性明显低于同年龄对照组，且其脑内的淀粉样斑块较同龄对照组明显减少［6］。
        炎性蛋白质及小胶质细胞活化同AD病变间的密切关系，使人们提出了神经退化的免疫炎症学说。该学说认为β-AP的沉积是AD病理过程的最初事件，但βAP本身无神经毒性，也不会引起明显的神经症状，但却可以诱发包括神经胶质细胞增生、炎症细胞和化学因子激活在内的一系列炎症反应，促使神经细胞产生神经纤维缠结并导致神经细胞的死亡或加速凋亡。从而引发一系列临床征象，并使AD大脑内的炎症反应得以不断延续和增强，病灶得以不断的扩展。然后又进一步加强炎症反应，这种正反馈环路形成了炎症反应的级联放大效应，使AD病情急速加重［7］。
        IL1β能通过刺激APP的启动子来上调APP基因表达，促进APP的加工过程，导致Aβ沉积［8］。故IL1β是促进Aβ凝聚沉积的刺激因子，由于APP的过量表达与Aβ沉积及AD的神经病理改变密切相关，而IL1β又是导致APP过量表达的重要因素。Viel等将Aβ加入到培养的胎鼠、中年鼠和老年鼠的小胶质细胞中，发现老年鼠细胞产生TNFα比其他细胞多；星形胶质细胞在TNFα作用下可产生βAP，增加脑内βAP负荷，促进淀粉样斑块形成，损害神经元［9］。细胞因子的过度表达，可以激活AD脑内的一系列炎症反应，形成炎症反应的级联放大效应，导致脑神经变形、Aβ沉积及SP形成，最终导致神经细胞死亡。因此，若能抑制TNFα和IL1β的分泌，就可减慢甚至调整这种恶性循环，从而减少脑神经细胞的死亡或凋亡，而达到防治AD的目的。
        为探讨炎性细胞因子在AD慢性炎性病理过程中的作用，我们采用双抗夹心酶联免疫吸附测定分别对AD大鼠血清中肿瘤坏死因子α和白细胞介素1β含量进行检测。结果发现模型大鼠血清TNFα和IL1β明显升高，而通络救脑口服液可显著降低模型大鼠血清异常增高的TNFα和IL1β含量，通络救脑口服液和盐酸多奈哌齐均有一定作用。尚不能说明通络救脑口服液对TNFα和IL1β的调节具有特一性。通过降低拟AD大鼠血清TNFα和IL1β的含量可能是通络救脑口服液发挥抗老年性痴呆作用的机制之一。
       【参考文献】
         　　［1］WyssCoray T.Inflammation in Alzheimer disease: driving force, bystander or beneficial response［J］.Nat Med. 2006, 12(9)：1005.
       
       ［2］Brain inflammation and oxidative stress in a transgenic mouse model of Alzheimerlike brain amyloidosis［J］. J Neuroinflammation. 2004, 1(1)：21.
       
       ［3］谢 宁，牛英才，宋 琳，等. 加减地黄饮子对Aβ40所致痴呆大鼠学习记忆、脑酶活性的影响［J］. 中医药信息, 2004, 21(2)：57.
       
       ［4］Rabano A, Jimenez-Huete A, Acevedo B, etal. Diversity of senile plaques in Alzheimer"s disease as revealed by a new monoclonal antibody that recognizes an internal sequence of the Abeta peptide［J］. Curr Alzheimer Res, 2005, 2(4)：409.
       
       ［5］Kostanian IA, Zhokhov SS, Storozheva ZI, et al. Neuroprotective effect of the hexapeptide HLDF-6 on neurons of rat hippocampus on the model of Alzheimer"s disease in vivo and in vitro［J］. Bioorg Khim. 2006, 32(4)：399.
       
       ［6］Zonderman AB. Predicting Alzheimer"s disease in the Baltimore longitudinal study of aging［J］. J Geriatr Psychiatry Neurol. 2005, 18(4)：192.
       
       ［7］Morihara T, Teter B, Yang F, et al. Ibuprofen suppresses interleukin-1beta induction of pro-amyloidogenic alpha1-antichymotrypsin to ameliorate beta-amyloid (Abeta) pathology in Alzheimer"s models［J］. Neuropsychopharmacology. 2005, 30(6)：1111.
       
       ［8］Seabrook TJ, Jiang L, Maier M, et al. Minocycline affects microglia activation, Abeta deposition, and behavior in APPtg mice［J］. Glia. 2006, 53(7)：776.
       
       ［9］Viel JJ, McManus DQ, Smith SS,et al. Age- and concentrationdependent neuroprotection and toxicity by TNF in cortical neurons from betaamyloid［J］. J Neurosci Res. 2001, 64(5)：454.