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       【关键词】  离子对反相高效液相色谱
       摘要：目的：建立同时测定莲子心中四种异喹啉生物碱莲心季铵碱、莲心碱、异莲心碱、甲基莲心碱含量的离子对反相高效液相色谱(RPHPLC)法。方法：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，色谱柱：HibarTR，5 μm，250 mm×4.6 mm；流动相：乙腈水冰醋酸(55∶45∶1，每1 000 ml中加入4 g十二烷基磺酸钠)；流速：1.2 ml/min；检测波长：282 nm；柱温：30℃。结果：莲心季铵碱在0.94～2.82 μg，莲心碱在1.14～3.42 μg，异莲心碱在0.7～2.1 μg，甲基莲心碱在0.96～2.88 μg范围内均呈良好线性关系；并均具有较好的加样回收率(＞95%)。结论：该分析方法快速、准确、灵敏度高，重复性好，可用于同时对药材莲子心中四种异喹啉生物碱的含量测定。
       关键词：离子对反相高效液相色谱；莲心碱；异莲心碱；甲基莲心碱；莲心季铵碱；莲子心
       Determination of Four Isoquinoline Alkaloids in Plumula Nelumbini by HPLC Simultaneously
       PAN Yang， YANG Guangming， CAI Baochang
       (Pharmaceutical College, Nanjing University of Traditional Chinese Medicine, Nanjing 210029, China)
       Abstract:Objective:An ionpair RPHPLC method was established to determine the amounts of lotusine, liensinine, isoliensinine and neferine in Plumula Nelumbini(PNN)simultaneously.Methods:The column is packed with Hibar RT C18(5 μm, 250 mm×4.60 mm);The mobile phase consists of acetonitrile/H2O/glacial acetic acid(55∶45∶1)，with 4 g sodium lauryl sulfonate in 1 liter, at the flow rate of 1.2 ml/min and the detection wavelength is 282 nm while the column temperature is 30℃.Results:Lotusine, liensinine, isoliensinine and neferine were proved to be linear within the range of 0.94～2.82　μg, 1.14～3.42 μg,0.7～2.1 μg and 0.96～2.88 μg respectively,with the recovery of the four alkaloids all being above 95%.Conclusion:This method is feasible to determine these four isoquinoline alkaloids simultaneously in PNN with the advantages of quickness, accuracy, high sensitivity and good repeatability.
       Key words:HPLC; Lotusine；Liensinine；Isoliensinine；Neferine；Plumula Neumbini(PNN)
             
　　莲子心为中医临床习用药材，主产于湖南、湖北、福建、江苏、浙江等省，秋季采收莲子时，从莲子中剥取，晒干，一般以个大、色青绿、未经煮者为佳［1］。其具有消心安神通交心肾、涩精止血之功效，被历版《中国药典》所收载。但各版《中国药典》中莲子心质量标准制订均不完善，即使是2000版药典中，莲子心质量标准项下也只收载了生药性状、显微鉴别和生物碱的试管显色反应。
莲子心中主要共有的有效成分为莲心碱(Lien)，此外还含有异莲心碱(lsolien)、甲基莲心碱(Nef)和莲心季铵碱(Lot)［2，3］。关于莲子心生物碱的定量方法，从已有的文献中可以了解到，有库仑滴定法［4］、紫外分光光度法［5］、薄层扫描法［6～9］等，其中高效液相法应用最普遍。但很多报道都是只对莲子心中的1～2种生物碱进行含量测定［10～12］；也有同时对Lien，Isolien，Nef3种成分进行定量分析的研究［13，14］，采用的是离子对反相HPLC法［14］。本实验针对莲子心的4种异喹啉生物碱，建立离子对反相HPLC法使各成分均获分离，用以同时测定37个莲子心样品中的Lot，Lien，Isolien和Nef的含量。
       　1  实验材料
       1.1 仪器Agilent 1100HPLC仪，G1313自动进样器，G1322A自动脱气机，G1311A四元泵，G1316A柱温箱，G1315DAD检测器；WATER510泵，RHEODYNE7725i进样器，Water486可调节紫外检测仪，江申通用汉化色谱工作站for Windows，版本号：3.20自动进样器，G1322A自动脱气机，G1311A四元泵，G116A柱温箱，G1315DAD检测器；METTLER AE 240电子天平，SYZA石英亚沸高纯水蒸馏器，江苏信达仪器厂；H66025超声波清洗机，无锡超声电子设备厂。
       1.2 化学对照品莲子心的4种异喹啉生物碱均对从药材中提取分离得到，经UV，IR，1HNMR，13C NMR及MS确证结构，莲心碱(Lien)经HPLC归一法确定其为98%；异心莲碱(Isolien)为92.06%；甲基莲心碱(Nef)为96.61%；莲心季铵碱(Lot)纯度为98.76%，本实验均作为定量对照品。
       1.3 药材购自湖南、湖北、福建、江苏、浙江、江西、安徽等省，经南京中医药大学中药鉴定教研室吴德康教授鉴定均来源于莲科植物 Nelumbo nucifera Gaerhn。种子的幼叶及胚根。
       1.4 试剂甲醇，分析纯，上海化学试剂有限公司；乙腈，色谱纯，TEDIA，MADEIN USA；冰醋酸，AR，南京化学试剂一厂；十二烷基磺酸纳，CP，中国医药(集团)上海化学试剂公司；水为自制重蒸水。
       　2  方法与结果
       2.1 色谱条件色谱柱：Hibar       RT，5 μm，250 mm×4.6 mm，Purosphere， STAR RP18e， Lot， FC025769， Merck KGaA， Germany；流动相：乙腈水冰醋酸(55∶45∶1，每1 000 ml中加入4 g十二烷基磺酸钠)；流速：1.2 ml/min；检测波长：282 nm；柱温：30℃。
       2.2 对照品溶液制备分别取Lot对照品4.7 mg，Lien对照品5.7 mg，Isolien对照品3.5 mg，Nef对照品4.8 mg，精密称定，以甲醇定容至5 ml。各精密吸取100　μl，置1 ml容量瓶中，甲醇定容至刻度，作为生物碱混合对照品溶液。
       2.3 供试品溶液制备
       2.3.1 提取方法的考察莲子心生物碱的提取主要有以下几种方式：冷浸、冷浸超声、加热回流。用这三种方法分别用甲醇和氯仿两种不同极性的溶剂进行提取，取莲子心样品粗粉0.5 g，提取一次；(1)50 ml甲醇冷浸24 h；(2)50 ml甲醇冷浸12 h，再超声提取45 min；(3)50 ml甲醇回流提取2 h；(4)50 ml氯仿冷浸24 h；(5)50 ml氯仿冷浸12 h，再超声提取45 min；(6)50 ml氯仿回流提取2 h，均定容至50 ml，注入HPLC仪，结果表明，上述六者提取液的HPLC图谱十分相似，但通过峰面积值的比较，可以看出Lien，Isolien， Nef和 Lot在甲醇热回流的提取条件下，峰面积值最高，因此选择此条件进行提取。
       2.3.2 提取方法的优选本实验进行了均匀设计优选莲子心提取方法，采用U7(74)(表2)，考察了四因素：提取时间、甲醇用量、浸泡时间、提取次数。精密称取莲子心药材0.5 g，按照实验设计，浸泡，加热回流提取，提取液浓缩并定容至50 ml，共进行了7次实验。以提取液中生物碱的含量为考核指标进行比较。结果见表1。表1   醇提工艺的实验结果（略）
       将7次实验的结果，经计算机软件多元回归处理得回归方程如下：Y＝1 362 934-0.948 689A+0.310 764 5B+0.286 842 4C-0.438 137 9D；F＝0.514＜F0.05(19.247)，说明各因素诸水平之间并无显著性差异。优选出最佳提取方法为：A(45.61 min)，B(98.24 ml/g)，C(34.38 min)，D(1.76次)。结合实际情况，确定醇提参数为：浸泡时间为30 min，甲醇与药材比例为100 ml/g，加热回流2次，25 min/次。
       2.3.3　供试品溶液的制备精密称取莲子心样品0.5 g，浸泡30 min，甲醇与药材比例为100 ml/g，回热回流2次，25 min/次，合并滤液，定容至50 ml，取约2 ml用0.45 μm针筒式微孔滤膜过滤，得续滤液约1.5 ml置进样瓶中。
       2.4　方法学考察
       2.4.1  线性关系考察以混合标准品溶液依次进样10，15，20，25，30 μl，以含量(μg)为横坐标(X)峰面积为纵坐标(Y)分别进行线性回归。结果表明：Lot，Lien，Isolien，Nef在线性范围内呈良好线性关系。
       2.4.2 稳定性考察取同一供试品(No.24)，按2.3.3项下制成供试品溶液，分别于1，2，4，8，16，24，54 h进样20 μl，测定供试品中各生物碱峰面积值。结果表明，供试品溶液在54 h内稳定性良好。
       2.4.3 精密度考察精密吸取上述供试品溶液20 μl，连续进样5次，测定供试品中各生物碱峰面积值。结果表明，该方法精密度良好。
       2.4.4 重现性考察取同一样品，按照2.3.3方法平行制备5份供试品溶液，依次进样，进样量20 μl，测定供试品中各生物碱峰面积值。结果表明，该方法重现性良好。
       2.4.5 回收率考察采用加样回收法。精密称取已知含量的样品约0.25 g，精密称定，精密加入混合对照品溶液，按供试品溶液制备方法制得供试品溶液，依法测定，按下式计算，平均加收率(%)结果如下：Lot为99.02%；Lien为104.10%；Isolien为98.02%；Nef为106.69%，表明本法具有良好的加样回收率。
       2.5样品测定取不同产地的莲子心粗粉，按上述条件与方法，依法测定。结果见表2。表2 莲子心中Lot,Lien,Isolien,Nef的含量测定%编（略）
       3  结果与讨论
       3.1  由上述结果可以看出，不同产地莲子心中各种生物碱的含量相差甚大，Lien 0%～1.854%；Isolien 0%～1.337%；Nef 0%～1.185%；Lot 0.115%～0.818%；总生物碱 0.787%～2.289%。可见其中Lot含量和生物碱总含量各样本差异不大，37个样本的RSD(%)分别为18.72和22.3。四种生物碱含量的高低似乎与产地关系不大，即便是同产地的莲子心，其 Lien，Isolien， Nef和 Lot的含量也相差很大，那么其含量高低是否与栽培品种、采收季节、加工方法或贮藏条件有关，有待进一步研究。
       3.2 一般认为莲心碱为莲子心中生物碱的主要有效成分，但 Lien，Isolien，Nef均为双苄基异喹啉类生物碱，有抗心率失常等心血管系统作用；Lot虽为单苄基异喹啉类生物碱，虽无明显抗心律失常作用，但有强而持久的降压作用。因此，单以Lien评价莲子心药材的质量欠妥，应以含量较稳定的4种生物碱的总量来进行定量分析。
       3.3 莲子心中 Lien，Isolien，Nef 和Lot对心血管疾病均有一定作用，中医用于热入心包、神昏谵语，临床应用前景广阔，我国莲子心资源丰富，很有开发价值。
       　　参考文献：
       ［1］江苏新医学院.中药大辞典，下册［M］.上海：上海科学技术出版社，1986：18061806.
       ［2］吕武清，郑海华，葛新.莲子心的研究概况［J］.中草药，1996，27(7)：438440.
       ［3］张弦，潘扬.植物莲中生物碱类成分的研究概况［J］.南京中医药大学学报(自然科学版)，2000，18(6)：382384.
       ［4］徐礼，刘爱茹.莲子心中生物碱及黄酮类成分的测定［J］.药物分析杂志，1991，11(6)：349351.
       ［5］张先洲.紫外分光光度法测定莲心碱的含量［J］.药物分析杂志，1991，(3)：183183.
       ［6］胡学民，周本宏，罗顺德，等.薄层扫描法测定莲子心中莲心碱的含量［J］.中草药，1992，23(11)：575576.
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       ［12］张先洲，蔡鸿生，周延安，等.HPLC同时测定莲子心中莲心碱和甲基莲心碱的含量［J］.西北药学杂志，1994，9(6)：243245.
       ［13］张先洲，胡学民，罗顺德，等.高效液相色谱法测定莲子心中3种生物碱的含量［J］.药物分析杂志，1997，17(2)：110112.
       ［14］寿国香，刘冰，周立红，等.离子反相HPLC法测定10个产地莲子心中莲心碱的含量［J］.中草药，2001，32(1)：989990.
       基金项目：江苏省教育厅自然科学基金项目(No.JW970081)
       作者简介：潘扬(1964)，男(汉族)，江苏扬州人，现任南京中医药大学药学院副研究员，硕士生导师，博士学位，主要从事中药有效成分研究工作.
       (南京中医药大学药学院， 江苏 南京210029)
       收稿日期：20050518