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       【摘要】 
       目的观察脑梗饮对大鼠局灶性脑缺血再灌注脑组织损伤的保护作用，并进一步探讨其作用机制。方法采用大脑中动脉栓塞法制作大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤模型。分别运用免疫组化、TTC染色和Zea Longa 5分制评分法，观察脑梗饮治疗后脑组织中Bcl2蛋白表达、梗塞体积以及神经行为变化。结果与模型组比较，治疗组神经功能损害症状明显减轻（P＜0.05）；脑梗塞体积缩小约40%；在各时点Bcl2表达均高与模型组（P＜0.05）。结论 脑梗饮通过益气养阴、活血通络等综合调控措施不仅能上调凋亡抑制基因Bcl2表达，缩小脑梗塞体积，而且能改善神经损伤症状，减轻脑组织结构损伤，对脑缺血再灌注引起损伤有明显保护作用。
       【关键词】  脑梗饮 Bcl2蛋白 缺血再灌注损伤
       Experimental Study of the Protective Effects of Naogengyin on Cerebral Ischemia-reperfusion Injury in Rats
       REN Shouzhong, SHI Zhiyong,  WANG Youqi,ZHANG Junqing, LIU Mingsheng
       1.Department of Pharmacy, Hainan Medical College，Haikou 571101,China;
       2.Guanganmen Hospital,China Academy of TCM,Beijing 100053,China;
       3.Institute of Chinese Medicine,Liaoning，Shenyang 110032,China
       Abstract：ObjectiveTo measure the protective effects of Naogengyin on cerebral ischemiareperfusion injury in rat and its mechanisms.MethodsThe model of focal reperfusion injury after cerebral ischemia in rats was made by middle cerebral artery occlusion. The effect of Naogengyin on expression of Bcl2 proin ,cerebral infarct volume and behavioral change in rats brain tissue were observed by immunohistochemical method,TTC staining and Zea Longa method respectively.ResultsCompared with the control group,neurological grades in Naogengyin group were lower(P＜0.05).The volume of cerebral infarction decreased 40% in treated groups. Bcl-2 expression of the treated groups increased more than that of the control groups in each hour point . There was great difference between the control groups and treated groups in expression of Bcl2 protein (P＜0.05).ConclusionNaogengyin has great cerebral protective effects against ischemia-reperfusion injury by increasing restrain mechanisms of the apoptosis of neuronal cell and expression of Bcl2 protein,reducing the volume of cerebral infarction and damage to brain tissue.
       Key words：Naogengyin；  Bcl2protein；   Ischemiareperfusion
        急性脑缺血——再灌注（IR）损伤可引起严重的神经功能障碍，甚至危及生命，寻找有效的治疗药物及措施以促进卒中后中枢神经系统功能恢复，一直是相关学科研究的重点之一。近年来关于中医药脑保护作用的研究也越来越受到重视。脑梗饮是王幼奇教授临床防治中风病常用经验方，在多年的临床应用中取得良好疗效。本研究从抑制脑神经细胞凋亡和缩小脑梗塞体积角度研究脑梗饮的作用机制。
       1  材料与方法
       1.1  材料
       健康Wistar大鼠42只，体重250～300 g。脑梗饮由黄芪、生地、三七、生蒲黄等组成，以上药物经水煎过滤浓缩成100 ml（含生药1.2 g/ml）。Bcl2单克隆抗体，DAB显色试剂盒，HIGHSAB试剂盒均购自武汉博士德公司。
       1.2  方法
       1.2.1  造模方法参照文献采用改良Koizumis法［1］制备MCAO动物模型。结扎大鼠颈外动脉， 自颈总动脉分叉处向颈内动脉插入栓线(18.5±0.5)mm，阻断大脑中动脉血流，造成局灶性脑缺血。术后将栓线尾部置于皮下，缺血2 h后轻拔栓线造成血流再灌注。存活大鼠再灌注6，12，24 h后观察大鼠行为变化。
        进行行为评分参考Zea Longa的五分制评分标准：①0分：正常，无神经损伤症状；②1分：对侧前爪部分屈曲或完全屈曲；③2分：向偏瘫侧转圈；④3分：向偏瘫侧倾倒；⑤ 4分：不能自发行走，意识丧失。假手术组，除不插线外，其余步骤同上。
       1.2.2  分组与给药将造模成功动物随机分为假手术组、模型组和治疗组。除假手术组外，其余两组每组再分为缺血再灌注后6，12，24 h 3个小组，总计7小组，最终手术合并实验成功35只，每组5只。假手术组、模型组和治疗组分别于术前1周按1 ml/100 g/次，2次/d连续灌胃给予盐水和脑梗饮。治疗组于术前3 h及术后3，6，12 h分别再灌胃给药1次。
       1.2.3  脑组织Bcl2蛋白检测大鼠分别于缺血再灌注后不同时间点，过量麻醉，打开胸腔，暴露心脏，用4℃肝素化生理盐水（2×105 u/L）150 ml快速冲洗，继以0.1 mol/L磷酸缓冲液（pH7.4）配制的4%多聚甲醛灌注固定30 min，然后断头取全脑，经4%多聚甲醛固定24 h，然后行梯度酒精脱水，二甲苯透明，浸蜡，包埋。用切片机在视交叉层面冠状切片，切片厚7 mm。每组间隔取5张切片，进行免疫组化检测。
        在多媒体病理图像分析仪（CMIAS008型，北京航空航天大学研究）下，计数每个视野中的阳性细胞数和阴性细胞数，最后计算阳性细胞百分率，阳性细胞百分率=阳性细胞数/（阳性细胞数+阴性细胞数）×100%。
       1.2.4  脑组织形态学的观察  将脑组织切片按普通石蜡切片方法进行脱水、透明、浸蜡、包埋、切片后做HE染色，观测脑组织形态学变化。
       1.2.5  红四氮唑（TTC）染色观察  断头处死，取出大脑，距额极2.5 mm处，间隔2.5 mm制作8片冠状切片。将切片置于2%氯化2，3，5三苯基四氮唑液（TTC）中，37℃避光温育30 min，然后移至0.1 mol/L PBS配制的4%多聚甲醛液中固定。照相并应用计算机图像处理及分析系统，计算每张切片脑梗塞面积，根据切片脑梗塞面积及切片距离，计算脑梗塞体积。
       1.2.6   统计学处理所有数据均经SPSS10.0统计软件处理，结果以(±s)表示，采用方差分析进行各组间比较。
       2  结果
       2.1  一般情况观察模型组及治疗组均于清醒后出现自主活动减少，随着时间延长自主活逐渐增加。治疗组恢复较模型组明显加快。
       2.2  神经功能评定假手术组大鼠均无异常行为，行为评分为0分；模型组大鼠出现对侧前肢不能伸展，向瘫痪侧转圈或向瘫痪侧倾倒的神经损伤症状，行为评分（1.8±0.68）。治疗组神经损伤症状较轻，仅有对侧前肢不能完全伸展，行为评分（0.6±0.47）分。结果见表1。表1  大鼠缺血——再灌注后神经行为评分（略）
       2.3  脑组织形态学改变假手术组神经细胞数量多，形态基本正常，轮廓清晰。缺血后6 h，模型组缺血灶中心区部分神经元消失，出现较多的红色细胞和鬼影细胞及少量形态完整的可逆性受损细胞；缺血24 h后，模型组出现大片脑组织缺血坏死，病灶中心区神经元细胞明显脱失，范围较6 h增大，坏死灶周围胶质细胞增生明显。治疗组在各时间点缺血范围都缩小，坏死面积也减小，梗塞边缘组织结构未完全破坏，神经元受损明显减轻，缺血区神经细胞数量明显增加。见图1～6。                      
       2.4  组织梗死体积脑组织在TTC染色时坏死组织呈苍白色，未坏死组织呈红色。假手术组脑组织无梗塞；模型组缺血侧脑组织有梗塞现象，梗塞体积占全脑36.10%；治疗组缺血侧脑梗塞体积较模型组缩小了40%（P＜0.05 ）。结果见表2。表2  大鼠脑缺血再灌注后脑梗塞体积比较(略)
       2.5  Bcl2蛋白的表达假手术组未见Bcl2蛋白表达。其余两组各时点均见Bcl2蛋白的表达，再灌注6 h，Bcl2阳性细胞少量表达，12 h表达明显，24 h表达又减少。治疗组在各时点Bcl2表达均高于模型组，两组间有明显差异（P＜0.05 )，其中，以12 h增高最明显(见表3及图7～12)。表3  脑缺血两组Bcl-2阳性细胞数百分率比较(略)
       3  讨论
        脑血管病在中医学中属于“中风”“偏枯”“半身不遂”“卒中”等范畴。其病因主要是由于年老体衰、气阴两虚，血淤络阻所致。本病以气阴两虚为本，淤血阻络为标，虚实夹杂，气虚血淤贯穿疾病的整个过程。脑梗饮以益气养阴，活血通络为治疗大法，主要用于治疗气虚或气阴两虚之中风病。
        现代药理研究表明［2］：黄芪具有增强细胞生命力和抵抗力，增强小鼠耐缺氧能力以及抗氧化、抗衰老等作用;生地具有扩血管、改善血液流变学、增加脑血流量、清除氧自由基、抗氧化等作用;三七具有抗血小板聚集、抗凝血酶和促进纤维蛋白降解而抗血栓形成以及抗氧化、抗自由基损伤、促进梗塞区侧支循环形成、改善微循环、膜稳定等多方面的作用。
        脑血管病是目前危害人类健康的三大疾病之一。其损害机制包括氧化应激、兴奋性氧基酸毒性、 炎症反应、钙超载及细胞凋亡等。其中细胞凋亡是脑缺血再灌注后迟发性神经细胞死亡的关键。
        神经细胞凋亡过程涉及到多种因子表达失控和调节异常，在神经系统中，现已知与凋亡相关的基因基本分为两大类：一类是促进细胞凋亡的基因，如bax，bclxs，bad，bak，cfos，cjun，p53等，另一类是抑制细胞凋亡的基因，如Bc12，BclXL，BClW，mcl1［3］。其中原癌基因Bcl2具有抑制凋亡的特性，是第一个被确认为能对抗细胞凋亡的基因，其特异性抑制细胞凋亡的作用已引起学者们的广泛关注。Bcl2通过多种机制抑制细胞凋亡：(1)抗各种脂质过氧化反应；(2)抑制线粒体释放促凋亡蛋白；(3)拮抗促凋亡基因；(4)抑制细胞内钙超载；(5) 抑制富含半胱氨酸蛋白酶的激活［4］。本实验结果显示脑梗饮可明显上调Bcl2蛋白表达，治疗组在各时间点Bc12蛋白的表达均高于模型组，其中，在12 h，Bc12蛋白的表达达到高峰。说明中药脑梗饮能改善缺血再灌注所致神经元内Bcl2蛋白含量减少，促进神经元内Bcl2蛋白的表达，从而对神经元起到了保护作用，减轻了脑缺血再灌注对脑组织损伤，有关脑梗饮上调Bcl2蛋白表达机制还有待与进一步研究。
        大量实验研究发现局灶性脑缺血后Bcl2蛋白的表达可以减少脑梗塞体积。Hata等在Bcl2蛋白基因鼓除的大鼠局灶性脑缺血1 h后发现 Bcl2蛋白缺如不影响脑血流，但是脑梗塞体积显著增加。本实验结果显示：模型组脑梗塞体积占全脑36.1%，而治疗组梗死体积仅占全脑21.66%，治疗组脑梗塞体积较模型组减少了40%，二组间有明显差异（P＜0.05）。这与潘殿卿等［5］国内外文献报道相一致，而且，在脑组织结构损伤方面，二组也有明显区别：与模型组比较，治疗组梗塞边缘组织结构未完全破坏，缺血区神经细胞数量明显增加，核固缩减少，神经元泡沫样改变明显减少。说明脑梗饮具有明显缩小脑梗塞体积和减轻缺血再灌注所致脑组织结构损伤的作用。其作用机制可能有以下几个方面：①通过提高Bcl2表达而减少梗死体积；②抑制Ca2+内流、减少自由基产生、减轻神经细胞的死亡；③增加缺血区的脑血流量；④抗血小板聚集和抗血栓形成。
        此外，本实验研究结果还发现治疗组大鼠的自主活动较模型组恢复明显加快，且在神经功能评分方面，模型组出现明显神经功能损伤症状如大鼠向瘫痪侧转圈，倾倒甚至不能站起或昏迷等症状。而治疗组神经损伤症状较轻，仅对侧前肢不能完全伸展，少数向瘫痪侧转圈，无倾倒、昏迷等症状。表明脑梗饮可显著改善脑缺血再灌注所致神经损伤症状，这与本方益气养阴，活血通络之功效密切相关。
        总之，通过本实验研究，进一步证实了脑梗饮保护脑缺血再灌注损伤作用，它可以从多方面、多角度、多靶点发挥抗缺血再灌注后脑神经细胞损伤，这为临床扩大应用提供了可靠的理论及实验依据。
        
       【参考文献】
         　　［1］Nagasawa H, Kogure K.Correlation between cerebral blood flow and histologic changes in a new rat model of middle cerebral artery occlusion［J］.Stroke,1989,20:1037.
       
       ［2］王本祥.现代中药药理学［M］.天津：天津科学技术出版社，1999：1175.
       
       ［3］Macaya A ,Apoposis in the nervou system［J］.RevNeurol,1996,24(135)：1356.
       
       ［4］马宏钟，薛荣亮.Bcl2相关蛋白与细胞凋亡和脑缺血再灌注损伤［J］.《国外医学》麻醉学与复苏分册，2001，22（6）：362.
       
       ［5］潘殿卿，李志梅.神经保护剂的鸡尾酒疗法对大鼠局灶性脑缺血后脑梗塞体积和神经元凋亡及蛋白表达的影响［J］.中华神经科杂志，2004，35（2）： 75.