高效液相色谱法测定黏膜溃疡含片中儿茶素和表儿茶素的含量
作者:钟世红
作者单位:成都医学院,四川 成都 610083;
《时珍国医国药》 2007年 第6期
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【摘要】
目的建立黏膜溃疡含片中儿茶素和表儿茶素的含量测定方法。方法采用高效液相色谱法,以0.04 mol·L-1枸橼酸N,N二甲基甲酰胺-四氢呋喃(45∶8∶1)为流动相,检测波长265 nm。结果儿茶素和表儿茶素分别在0.103~2.568μg(r=0.999 9)和0.011~0.275 μg(r=0.999 9)范围内线性关系良好,平均回收率分别为102.17%和99.84%,RSD分别为1.69%和1.44%。结论 该方法简便、准确、重现性好,可用于该制剂的质量控制。
【关键词】 黏膜溃疡含片 儿茶素 表儿茶素 高效液相色谱法
Determination of Catechin and Epicatechin in NianMoKuiYang Buccal Tablet by HPLC
ZHONG Shihong, HE Yuxin,LI Yi
1.Chengdu Medical College,Chengdu 610083,China;
2.Xihua University,Chengdu 610039,China
Abstract:ObjectiveTo establish a determination method for Catechin and Epicatechin in NianMoKuiYang Buccal Tablet. MethodsHPLC method was selected. The mobile phase was 0.04 mol·L-1 citric acid-N,Ndimethylformamidetetrahydrofuran(45∶8∶1).The detection wavelength was set at 265 nm.ResultsThe linear ranges for Catechin and Epicatechin were 0.103~2.568 μg(r=0.999 9)and 0.011~0.275 μg(r=0.999 9),respectively. Its average recoveries were 102.17% with RSD of 1.69% and 99.84% with RSD of 1.44%, respectively. ConclusionThe method is simple, reliable and reproducible. It can be used for quality control of NianMoKuiYang Buccal Tablet.
Key words:NianMoKuiYang Buccal Tablet; Catechin; Epicatechin; HPLC
黏膜溃疡含片由儿茶、青黛、冰片共三味药组成,具有清热解毒、收敛止痛的功效,用于热毒内盛而致的咽喉肿痛、口舌生疮以及其它黏膜溃疡的治疗。儿茶为方中君药之一。儿茶素和表儿茶素为儿茶中主要有效成分。本文采用高效液相色谱法测定了黏膜溃疡含片中儿茶素和表儿茶素的含量。
1 仪器与试药
高效液相色谱仪(日本岛津LC10A)。上海必能信CQ250型超声波清洗器。UV1000型紫外-可见分光光度计(上海天美科学仪器有限公司)。儿茶素和表儿茶素对照品(中国药品生物制品检定所,批号分别为87720001和110878200102,供含量测定用)。黏膜溃疡含片(某药厂提供,规格为0.45 g/片)。四氢呋喃为色谱纯,水为重蒸馏水,其它均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
色谱柱为Hypersil ODS2C18(5 μm, 150 mm×4.6 mm) 0.04 mol·L-1枸橼酸N,N二甲基甲酰胺-四氢呋喃(45∶8∶1);流速1.0 ml·min-1;检测波长265 nm;柱温35℃。
2.2 对照品溶液的制备
精密称取儿茶素对照品10.70mg,置50 ml棕色量瓶中,以甲醇∶水(1∶1)溶解并稀释至刻度,作为儿茶素对照品贮备液(0.214 mg·ml-1)。另精密称取表儿茶素对照品8.60 mg,置50 ml棕色量瓶中,以甲醇:水(1∶1)溶解并稀释至刻度,作为表儿茶素对照品贮备液(0.172 mg·ml-1)。精密量取儿茶素贮备液15 ml和表儿茶素贮备液2ml置同一25 ml棕色量瓶中,加甲醇:水(1∶1)稀释至刻度,作为混合对照品溶液(儿茶素:0.128 4 mg·ml-1;表儿茶素:0.013 8 mg·ml-1)。
2.3 供试品溶液的制备
取样品0.20 g,精密称定,置具塞锥形瓶中,加入甲醇-水(1∶1)50 ml,密塞,称定重量,超声处理(功率250 W,频率40 kHz)20 min,取出,放冷,再称定重量,以甲醇水(1∶1)补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液,即得。
2.4 阴性溶液的制备
按处方制得缺儿茶的阴性样品,同样品方法处理,制成阴性溶液。
2.5 空白对照实验
分别取对照品溶液、供试品溶液、阴性空白对照溶液,按上述色谱条件测定。结果见图1,表明空白无干扰。
2.6 线性关系考察
分别精密移取上述混合对照品溶液1 ml(儿茶素0.128 4 mg·ml-1;表儿茶素0.013 8 mg·ml-1),置2,5,10,25 ml量瓶中,加流动相稀释至刻度,摇匀。分别精密吸取上述混合溶液各20 μl,在上述色谱条件下进行检测,测定儿茶素、表儿茶素峰面积,以峰面积积分值Y为纵坐标,对照品进样量X为横坐标,经线性回归分析,得儿茶素的回归方程为y = 422 798x + 6 437.4,r=0.999 9,表儿茶素的回归方程为y = 448 267x + 484.17,r= 0.999 9,儿茶素在进样量为0.103~2.568 μg范围内,表儿茶素在进样量为0.011~0.275 μg范围内,呈良好的线性关系。
2.7 精密度实验
精密吸取上述混合对照品溶液(儿茶素0.128 4 mg·ml-1;表儿茶素0.013 8 mg·ml-1)10 μl,重复进样6次,按上述色谱条件测定峰面积,结果儿茶素、表儿茶素的RSD分别为0.38%,0.57%。
2.8 重复性实验
取同一批号样品(批号050701)6份,按上述方法分别制备成供试品溶液,精密吸取10 μl注入液相色谱仪,测定峰面积,计算得儿茶素平均含量为18.27 mg·g-1,RSD为1.71%;表儿茶素平均含量为2.10 mg·g-1,RSD为1.04%。
2.9 稳定性试验
取样品(批号050701),同法制备供试品溶液,分别于0,2,4,6,8 h,精密吸取10 μl注入液相色谱仪,记录峰面积。测得儿茶素和表儿茶素的RSD分别为1.53%和0.83%。结果表明,供试品溶液在8 h内稳定。
2.10 加样回收率实验
取已知含量的样品(批号050701)粉末6份,每份约0.1 g,精密称定,分别精密加入0.214 mg·ml-1的儿茶素对照品储备液7.5 ml和0.172 mg·ml-1的表儿茶素对照品储备液1.2 ml,按上述供试品溶液制备方法制备加样回收率供试品溶液,精密吸取10 μl注入液相色谱仪,测定峰面积。结果见表1~2。表1 儿茶素回收率实验(略)表2 表儿茶素回收率实验 (略)
2.11 样品测定
取3个批号样品,分别按供试品溶液的制备方法处理,分别精密吸取对照品溶液与样品溶液各20 μl,按上述色谱条件,注入高效液相色谱仪进行测定。结果见表3。表3 黏膜溃疡含片中儿茶素、表儿茶素的含量(略)
3 讨论
3.1 参考《中国药典》2005年版(Ⅰ部)儿茶项下含量测定色谱条件[1],发现表儿茶素分离度欠佳,因此,适当调整流动相比例,实验确定流动相为:0.04 mol·L-1枸橼酸N,N二甲基甲酰胺四氢呋喃(45∶8∶1),在此条件下表儿茶素峰形对称、尖锐,理论塔板达10 000,考虑到不同仪器、色谱柱的性能可能存在差异,故定理论板数应不低于4 000。
3.2 本实验前期拟采用国产商品儿茶,经测定3批国产儿茶样品,其儿茶素与表儿茶素总量低于10%,因此本实验采用进口儿茶作为制剂的原料药材。
3.3 文献报道[2],儿茶素与表儿茶素稳定性差,实验证明,在室温下,表儿茶素对照品溶液颜色逐渐变深,且含量明显下降。因此,本实验将上述两对照品配置在棕色量瓶中,-4℃冰箱中放置,一周后,两对照品颜色及其含量无变化。
3.4 该方法灵敏度高,结果准确,可用于黏膜溃疡含片的质量控制。
【参考文献】
[1]国家药典委员会.中国药典,Ⅰ部[S].北京:化学工业出版社,2005:8.
[2]王刚力,于健东,田金改,等.儿茶药材化学成分分析——反相高效液相色谱法测定儿茶中儿茶素和表儿茶素的含量[J].药物分析杂志,1999,12(2):90.