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       【摘要】 
       目的探讨桦褐孔菌石油醚提取物（Inonotus Obliquus Petroleum ether Extracts ,IOPE）抗肿瘤作用。方法体外实验采用MTT法测定了IOPE对Hela肿瘤细胞的抑制率。体内实验，将接种S180肿瘤细胞后的小鼠随机分为5组，每组10只，给予IOPE 10d，停药后24 h处死动物，称体重，摘出肿瘤，测定肿瘤抑制率、脾指数、胸腺指数、淋巴细胞转化率、NK细胞活性。结果在体外，IOPE对Hela肿瘤细胞具有毒性作用；体内实验表明中大剂量IOPE对荷瘤小鼠肿瘤生长具有抑制作用，可增加脾指数及胸腺指数，对体外淋巴细胞转化功能和NK细胞活性亦有增强作用。结论桦褐孔菌石油醚提取物具有明显的抗肿瘤活性。
       【关键词】  桦褐孔菌石油醚提取物 抗肿瘤
       The Experimental Study on Antitumor Effect of Petroleum Ether Extracts of Ionontus Obliquus
       JI Feng, ZHENG Weifa, WEI Xianyong, ZONG Zhimin, CHEN Lili，HONG Wen
       1. China University of Mining and Technology, Xuzhou 221012, China;
       2.Xuzhou Air Force College, Xuzhou 221006 , China;
       3.Xuzhou Normal University,Xuzhou 221012, China;
       4.Health Section of Unit 73081  221000,China;
       5.Xuzhou MeiJi Hospital,Xuzhou 221000,China
       Abstract：ObjectiveTo study the antitumor effect of petroleum ether extracts of Inonotus Obliquus (IOPE).MethodsIn vitro test, the tumor inhibitory effects to Hela cells were studied by MTT method. In vivo, the mice were inoculated with S180 tumor cells and divided into 5 groups randomly (n=10), which were administered IOPE 10 d continuously. The mice were killed and weighed 24 h after the last administration, and the inhibition ratio of the tumor weight in the spleen index, thymus index , transformation function of lymphocyte and NK cell activities were calculated. ResultsThe vitro test showed IOPE had significant acute toxicity to the Hela toumor cells. The IOPE could increase the levels of inhibition ratio of tumor weight and the spleen index and thymus index in mice and increase the transformation function of lymphocyte and NK cell activities in vitro.ConclusionThe IOPE has obvious antitumor effect.
       Key words：Petroleum ether Extracts of Inonotus obliquus (IOPE)；  Antitumor
        桦褐孔菌Inonotus obliquus 是一种大型真菌，主要分布于北纬45～50°的地区，如俄罗斯西西伯利亚、远东地区、中国黑龙江、吉林省长白山地区等。作为一种民间草药，桦褐孔菌在俄罗斯等国家已有很长的使用历史。近年的研究也表明，它在抗肿瘤、抗HIV、治疗糖尿病等方面都具有一定的潜力［1～5］。成分研究表明，桦褐孔菌低极性提取物中含有大量的三萜类化合物，主要为羊毛甾醇、桦褐孔菌醇及其衍生物。本文通过体内和体外实验对桦褐孔菌中石油醚提取物抗肿瘤方面的作用及机理进行了研究。
       1  材料与方法
       1.1  药品的制备桦褐孔菌子实体购自大连王力灵芝行，由江苏省药用植物生物技术重点实验室郑维发教授鉴定，样品保存于江苏省药用植物生物技术重点实验室。
        将桦褐孔菌子实体称重、粉碎后用石油醚加热萃取多次，过滤。滤液经浓缩干燥后得到桦褐孔菌石油醚提取物，记为IOPE。
       1.2  动物与试剂
       1.2.1  动物及瘤株 
       昆明种ICR小鼠，体重为（20±2） g，徐州医学院实验动物中心提供，合格证号：苏动200402。自由摄食饮水，室温（25±2）℃。
        S180肉瘤细胞、Hela人宫颈癌细胞、K293人胚肾细胞，由中国科学院遗传与发育研究所提供。
       1.2.2  试剂MTT，美国Sigma公司产品；DMSO，美国Sigma公司产品；注射用环磷酰胺，江苏恒瑞药业股份有限公司产品，生产批号040221；生理盐水，徐州远恒药业有限公司产品，生产批号04121311；RPMI1640培养基、RPMI1640完全培养基，美国GIBCO公司产品；PBS溶液实验室自制。
       1.3  方法
       1.3.1  IOPE对肿瘤细胞的抑制实验［6］ 
       分别取对数生长期的Hela细胞及K293细胞（1×105/ml）接种于96孔培养板中，150 μl/孔，然后加入50 μl不同浓度的IOPE，总体积200 μl/孔，药品的终浓度为0，50，100，200，300，500 g/ml，每组均设6个样本孔。在37℃，5%CO2、饱湿条件下培养72 h，以MTT比色法测吸光度并计算药物对肿瘤细胞的抑制率和对K293细胞的生长促进率。
       1.3.2  IOPE对小鼠S180肉瘤的抑制作用实验［7］
       取传代后7d的S180肉瘤细胞悬液（2×106），每鼠右后腋窝皮下接种0.2 ml。次日随机分组，每组10只，于接种后24 h给药。分别为IOPE高剂量组(240 mg/kg)，中剂量组(120 mg/kg)，低剂量组(60 mg/kg)，环磷酰胺阳性对照组(20 mg/kg)，生理盐水对照组以及正常对照组，均以 0.2 ml/10 g灌胃给药，1次/d，连续10 d。末次给药后24 h，处死小鼠剥取瘤块，分离、摘取脾脏和胸腺，计算抑瘤率，脾指数和胸腺指数。
       1.3.3  淋巴细胞增殖实验［8］
       荷瘤小鼠按1.3.2条件给药10 d，于停药24 h后将小鼠放血致死，取脾，按文献制备脾细胞悬液。将脾细胞浓度调整为4×106/ml，向96孔板加入脾细胞悬液100 μl/孔，然后加入1 μg/ml的Con A 100 μl/孔，对照孔加RPMI 1640液，设5个复孔，置37℃，饱和湿度、5%CO2孵箱中培养72 h，以MTT法测OD值，以OD值大小反映淋巴细胞增殖反应。
       1.3.4  IOPE促进NK细胞活性实验［9］
       同1.3.3处理动物和制备脾细胞，取不同药物浓度处理的脾细胞作效应细胞，调整细胞浓度至1×106/ml，加入96孔培养板中，另取Hela细胞作为靶细胞，效应细胞:靶细胞=50:1，每份标本设3个复孔，同时设靶细胞对照组和效应细胞对照组，置37℃，5%CO2孵箱中培养4 h，并以MTT法于酶标仪570 nm波长处测光密度（OD）值，并计算NK细胞活性。
       1.4  数据处理所有数据均用SPSS 11.5软件进行处理，以t-检验计算组间的差异。
       2  结果
       2.1  IOPE对肿瘤细胞的抑制实验结果见表1。表1  桦褐孔菌石油醚提取物对Hela细胞和K 293细胞的增殖抑制（略）
        从实验结果可知，IOPE各剂量组对肿瘤的抑制率均大，且基本呈现出剂量依赖关系，细胞毒作用明显。同时多个剂量组IOPE对K293的生长都呈现较高的生长促进率，说明了IOPE对正常细胞的增殖无抑制作用。
       2.2  IOPE对小鼠S180肉瘤抑制率的影响结果见表2。表2  桦褐孔菌石油醚提取物对小鼠S180肉瘤的肿瘤抑制率的影响（略）
        结果表明，与空白对照组相比较，IOPE的中大剂量组对荷瘤小鼠的肿瘤均具一定程度的抑制作用。结果还表明，IOPE具有明显增加荷瘤小鼠脾指数和胸腺指数的作用，呈剂量依赖关系，且与阳性对照组间存在显著性差异。
       2.3  淋巴细胞增殖实验结果见表3。表3  桦褐孔菌石油醚提取物对小鼠淋巴细胞转化的促进作用（略）
        结果表明在Con A的诱导下荷瘤小鼠脾淋巴细胞增殖普遍低于正常小鼠，而中大剂量IOPE能有效提高实验OD值，且与阳性对照组存在显著性差异（P＜0.01），这表明IOPE能有效地促进淋巴细胞的增殖，能够提高荷瘤小鼠的免疫水平。
       2.4  IOPE促进NK细胞活性实验结果见图1。
        结果显示IOPE能有效促进NK细胞对靶细胞的杀伤活性，呈现出明显的剂量依赖关系，而且中大剂量组明显高于环磷酰胺阳性对照组和正常对照组的NK细胞活性。
       3  讨论
        从天然产物特别是大型真菌中筛选抗肿瘤活性物质是抗肿瘤新药物研发的一个重要方向。一般认为大型真菌是通过调节机体的免疫力，从而起到抗肿瘤的疗效的，但研究的重点多集中在真菌的水提物组分上。
        本研究通过体内外抗肿瘤实验和免疫药理学实验对桦褐孔菌多糖的抗肿瘤作用及机制进行了研究。体外对Hela肿瘤细胞的增殖实验表明当给药浓度为50 g/ml时，IOPE就具有直接杀死肿瘤细胞的细胞毒作用，并且呈现剂量依赖关系；同时实验还表明，IOPE对正常细胞的增殖无抑制作用，大浓度时甚至能明显促进细胞生长。体内抗肿瘤实验的结果表明，120 mg/kg以上剂量的IOPE灌胃给药时，对小鼠S180肉瘤均有一定的抑制作用。
        肿瘤的发生发展与机体的免疫调节功能密切相关，其中由T细胞介导的细胞免疫起着更重要的作用，T细胞的激活是发挥细胞免疫效应的重要条件。NK细胞缺乏免疫记忆和MHC约束性，能溶解广谱的肿瘤细胞、包括同基因的、同种异基因的，以及异种的靶细胞，是一类在早期肿瘤免疫机制中起重要作用的效应细胞，对机体抗肿瘤起着重要作用。本研究在证实IOPE具有良好抗肿瘤效果的基础上，探讨了IOPE对小鼠S180肉瘤的免疫调节作用及可能机理。实验表明IOPE对两个主要免疫学器官脾脏和胸腺均有增重作用，并呈剂量依赖性。与阳性对照组相比，中大剂量组IOPE可促进ConA诱导的体外小鼠淋巴细胞转化。同时，各剂量组IOPE对荷瘤小鼠体内NK细胞活性均有明显促进作用。以上结果显示，IOPE的抗肿瘤作用可能是通过其细胞毒作用及调节机体的免疫力，刺激T细胞、NK细胞等功能来实现的。
       【参考文献】
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