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       【摘要】 
       目的探讨生脉散复方制剂对病毒性心肌炎的影响。方法取新生SD大鼠心室肌培养48 h后接种103TCID50的柯萨奇B3病毒，观察生脉散合炙甘草汤加减液Ⅰ、生脉散合炙甘草汤加减液Ⅱ对感染病毒大鼠心肌细胞的影响。结果生脉散合炙甘草汤加减液Ⅱ明显减轻感染病毒后心肌病变，改善细胞搏动，明显降低心肌细胞释放酶（乳酸脱氢酶、磷酸肌酸激酶）活性，减轻超微结构病变。结论生脉散合炙甘草汤加减液Ⅱ对感染柯萨奇B3病毒SD大鼠培养心肌细胞具有抗病毒和明显的保护作用。生脉散合炙甘草汤加减液Ⅱ的作用优于不加虎杖的生脉散合炙甘草汤加减液Ⅰ。
       【关键词】  柯萨奇病毒B3 心肌炎 植物
       Effect of Pulse-activating Powder Combined with the Roast Glycyrrhiza Decoction on Cultured Rat Myocardial Cells Infected with Coxsackie Virus B3
       ZHENG Shanzi， SHEN  Chenghua, PIAO  Huazi
       College of Basic Medicine，Yanbian University ,Yanji  133000， China
       Abstract:ObjectiveTo study the anti-viral effect and its mechanism of pulse-activating powder combined with the roast Glycyrrhiza decoction adjusted juice Ⅱ（PGPⅡ） on the cultured rat myocardial cells were infected with Coxsackie virus B3.  MethodsThe beating myocardial cells were obtained from the ventricular myocardium of newborn Sparaque-Dawlrvey rats and incubated for 48 hours and inoculated with 103TCID50 of  Coxsackie virus B3 virus.The effect of pulse-activating powder combined with the roast Glycyrrhiza decoction adjusted juiceⅠ,( PGPⅠ) and PGPⅡ on the viral mupcarditis was obseced. ResultsThe PGPⅡ significantly alleviated the pacthological changes of myocardial cells, improved the percent of the beating cell, reduced the activities of lactate dehydrogenase and creatine phosphokinase and alleviated the ultrastructural  changes of myocardial cells infected with Coxsackie virus B3 (CVB3). ConclusionThe PGPⅡ has anti-viral effect and significant protective effect on SD rat myocardial cells infected by Coxsackie virus B3. The effect of PGPⅡ is better than that of PGPⅠwithout Polygonum cuspidatum.
       Key words:Coxsackie viruses B3；  Myocarditis；  Plants
        病毒性心肌炎是嗜心性病毒侵犯心脏引起的，以心肌坏死和间质内单核细胞、淋巴细胞浸润为主要病理变化的一种常见病。许多报道已证实该病的致病病毒最常见的是肠道病毒、ECHO病毒、风疹病毒、流行性感冒病毒、腮腺炎病毒，特别是与柯萨奇B3病毒有关.。根据中医学“益气养阴，活血化瘀”的基本治法所组成的复方生脉散合炙甘草汤加减液，在临床治疗病毒性心肌炎疗效较为满意，而且没有明显的毒副作用。为进一步探讨该药的对病毒性心肌炎的作用机制和不同方剂的组成，本实验以实验性体外病毒性心肌炎模型探讨了生脉散合炙甘草汤加减液Ⅱ的抗病毒和保护心肌损伤作用。
       1  材料和方法
       1.1  材料
       1.1.1  动物新生2～3 d的SD大鼠，由延边大学医学部实验动物科提供。
       1.1.2  病毒柯萨奇B3亲心肌病毒，由白求恩医科大学细胞生物学教研室提供。此病毒在Vero细胞中传代，反复冻融3次，测定得其TCID50为10-3/ml，分装后于-70℃冻存。
       1.1.3  药物及试剂生脉散合炙甘草汤加减液Ⅱ(PGPⅡ)是由2 g/L生脉散合炙甘草汤加减液Ⅰ(PGPⅠ)和1 g/L虎杖水煎液以1∶1比例组成。对照药物为2 g/L生脉散合炙甘草汤加减液Ⅰ。乳酸脱氢酶、磷酸肌酸激酶试剂盒为北京中生生物工程高技术公司产品。心肌细胞生长液为美国Biolabs公司产品，RPMI-1640为 Sigma公司产品。
       1.2  方法
       1.2.1  实验分组与病毒感染细胞及其形态学观察用常规法［1］分离新生大鼠心室肌，制成细胞悬液，计活细胞数，调整细胞浓度为5×105个细胞/ml接种于24孔组织培养板，置于含5% CO2及适宜湿度的培养箱中。每48 h换新培养基1次。实验共分4组。正常对照组；病毒对照组；阳性对照药物组：病毒加生脉散合炙甘草汤加减液Ⅰ组（PGPⅠ）；生脉散合炙甘草汤加减液Ⅱ组(PGPⅡ组)：病毒加生脉散合炙甘草汤加减液Ⅱ组。每组设8孔常规培养心肌细胞48 h，弃上清液，除正常组外各组单层细胞上加入0.5 ml含103TCID50CVB3的生长液。37℃孵育1 h后弃上清液，用Hank 氏液洗细胞2次。按分组加入正常和含药生长液1 ml/孔，置二氧化碳培养箱中继续培养。细胞搏动及细胞病变（CPE）均在加100目目镜计数器的倒置显微镜下观察。细胞病变积分以徐岩等的标准判定，为0，1，2，3，4分，分别表示无细胞病变、细胞病变少于25%、细胞病变为25%～50%、细胞病变为50%～75%及细胞病变多于75% 。
       1.2.2  心肌细胞释放酶检测感染病毒72 h后取4组各8孔细胞上清液，作乳酸脱氢酶、磷酸肌酸激酶活性的检测，用荷兰VITALmicro- lab200型生化半自动分析仪测定。重复作3次。
       1.2.3  细胞透射电镜样品制备及超微结构的观察感染病毒72 h后弃除原培养液，加入1 g/L 胰蛋白酶0.5 ml，把培养板放在倒置显微镜台上，镜下观察，待贴壁细胞胞质回缩，细胞间隙增大后，立即终止消化。吸除消化液，加入营养液用吸管轻轻反复吹打贴壁细胞，形成细胞悬液，分别置于离心管中，以1 500 r/min离心5 min，弃上清液，用PBS液漂洗2次，以去除培养液，所收集的各组心肌细胞经2.5%戊二醛和锇酸双重固定，丙酮逐级脱水，混合树脂包埋，LKB-V型超薄切片机切片。醋酸铀-柠檬酸铅双重染色，透射电子显微镜观察。
       1.2.4  统计学方法实验数据处理用±s表示。统计推断：用统计软件SPSS10.0进行多组间方差分析。
       2  结果
       2.1  细胞形态和搏动及细胞病变正常组心肌细胞培养48 h后细胞体宽大呈片状，形态不规则，核不清，搏动频率加快，60～100次/min，呈有力规律的同步搏动。病毒组感染病毒24 h后，细胞搏动无明显变化，细胞病变不明显；48 h时部分细胞停止搏动，细胞病变明显；72 h时多数细胞停止搏动，细胞病变较重，积分为(3.1±0.6)分。生脉散合炙甘草汤加减液Ⅱ组多数细胞搏动有规律，细胞病变积分为(1.0±0.5)分，与病毒组比较有差异(P<0.05)，与生脉散合炙甘草汤加减液Ⅰ组比较无差异(P>0.05)。结果见表1。表1  生脉散合炙甘草汤加减液Ⅱ对实验大鼠培养（略）
       2.3  心肌细胞释放酶测定感染病毒72 h时各实验组细胞培养液中乳酸脱氢酶、磷酸肌酸激酶活性上升，生脉散合炙甘草汤加减液Ⅰ组和Ⅱ组乳酸脱氢酶、磷酸肌酸激酶活性与病毒组比较明显降低（P<0.01）。生脉散合炙甘草汤加减液Ⅱ组的乳酸脱氢酶活性降低与生脉散合炙甘草汤加减液Ⅰ组比较，有显著差异（P<0.05），结果见表2。表2  生脉散合炙甘草汤加减液Ⅱ对实验大鼠培养（略）
       2.4  心肌细胞超微结构的病变正常组心肌细胞细胞膜完整，双层核膜清晰可见，胞质内线粒体丰富聚集于细胞内或沿肌丝走行排列，嵴清晰，呈板状紧密排列，糖原颗粒分布于线粒体周围或肌丝面。病毒组心肌细胞细胞膜被破坏，细胞器严重损伤，线粒体变性、肿胀，嵴断裂，内外膜结构不清，糖原颗粒消失，部分核膜双层结构不清晰，肌浆网扩张，并见大量脂肪滴沉积。生脉散合炙甘草汤加减液Ⅰ组心肌细胞部分线粒体破坏，有的线粒体轻度肿胀，周围可见糖原颗粒，肌原纤维排列整齐，有少量脂质沉积，但大部分心肌细胞保持基本形态。生脉散合炙甘草汤加减液Ⅱ组心肌细胞超微结构改变较轻。
       3  讨论
        在小鼠柯萨奇B3病毒性心肌炎模型中心肌损伤涉及两种机制，在病毒感染之初，若发生心肌损伤，多数属于柯萨奇B3病毒在细胞浆中利用心肌细胞提供的低分子量前提成分、能量、必要的酶与细胞器等作为原料合成病毒核酸与蛋白质，装配成病毒，并释放至细胞外，远期心肌损伤多于柯萨奇B3病毒引起的自身免疫性病变有关［2］。本实验中培养心肌细胞已去除了免疫因素，故感染柯萨奇B3病毒所引起的细胞病变直接归于其溶细胞作用。生脉散［3］最早见于《内外伤变惑论》，由人参、麦冬、五味子组成，具有益气养阴之功，炙甘草汤出自《伤寒论》，由炙甘草、人参、桂枝、生姜、生地、麦冬、大枣、麻仁、阿胶等九味药组成，具有补气滋阴、养血复脉之功效［4］。 虎杖［5］为蓼科蓼属多年生草本植物，具有祛风利湿、祛痰止咳、清热解毒、活血化瘀功能。本实验结果显示，生脉散合炙甘草汤加减液Ⅱ减轻感染柯萨奇B3病毒心肌细胞病变，改善细胞搏动，降低乳酸脱氢酶、磷酸肌酸激酶活性，减轻超微结构的病变。可能通过稳定心肌细胞膜，保护线粒体，增加心肌细胞能量供应，增强心肌细胞收缩功能，从而抑制病毒对心肌细胞的损伤，起保护心肌细胞的作用。实验结果中生脉散合炙甘草汤加减液Ⅱ作用优于不加虎杖的生脉散合炙甘草汤加减液Ⅰ，所以应用生脉散合炙甘草汤加减液治疗病毒性心肌炎时建议添加虎杖水煎液。
        在抗病毒性心肌炎病毒药体外实验中，抗病毒实验包括细胞病变抑制实验、病毒繁殖抑制实验及药物在Balb/C小鼠脾细胞上诱生干扰素等。本实验中细胞病变抑制实验结果能说明实验药物具有抗病毒感染的作用。本实验因实验条件有限，未测定感染病毒后细胞内病毒的增殖量和药物诱导产生的干扰素效价，因此有关生脉散合炙甘草汤加减液有无直接抗病毒复制的作用及能否诱导产生干扰素问题有待于更深入的探讨。
       【参考文献】
         　　［1］Yang Y. Coxsackie B2virus infection in rat beating hear culture cell［J］.J Viral ethods． 1985，12：217.
       
       ［2］熊丁丁.病毒介导的心肌损害在心肌炎发病机制中的作用研究进展［J］.心血管病学进展，1999，20(3)：156.
       
       ［3］严永清.生脉散口服液的综合研究［M］.北京：中国医药科技出版社，1990:128.
       
       ［4］王 肃.近十年来炙甘草汤临床应用概况［J］.安徽中医学院学报，1996，15（3）: 61.
       
       ［5］汪志洁. 虎杖大黄素抗HSV-2、CVB3病毒的作用初探［J］.安徽中医学院学报，1999，18（3）：4.