三物白散加味方癌化学预防作用实验研究
作者:徐力, 王明艳, 许冬青, 周春祥
《时珍国医国药》 2005年 第12期
多个检索词,请用空格间隔。
【关键词】 三物白散加味方;,,癌化学预防
摘要:目的:观察三物白散加味方癌化学预防作用。方法:进行三物白散加味方抗变、影响rasP21基因表达、抗氧化三项研究。结果:三物白散加味方中、大剂量组有抗变和降低rasP21基因表达作用;小剂量组有抗氧化作用。结论: 从初步研究认为,三物白散加味方具有癌化学预防作用。
关键词: 三物白散加味方; 癌化学预防
Experimental Research on Chemical Prevention Effects of Modified Sanwubai Powder
XU Li, WANG Ming yan, XU Dong qing, ZHOU Chun xiang
(Nanjing University of Traditional Chinese Medicine, Nanjing, Jiangsu 210029, China)
Abstract:Objective:To observe chemical prevention effects of Modified Sanwubai Powder.Methods:Anti mutation functions, gene expression of rasP21 and anti oxydizing functions were studied.Results:Modified Sanwubai San in high and moderate dosages had anti mutation functions and reducing rasP21 gene expression, low dosage had anti oxydizing functions.Conclusion:Modified Sanwubai Powder had the effects of chemical prevention for cancer in preliminary experiments.
Key words:Modified Sanwubai Powder; Chemical prevention for cancer; Experimental research
癌化学预防着眼于用药物或食物成分阻断癌变的发生及癌前病变的进展或使其逆转以控制、减少恶性肿瘤的发生,从理论上讲它应当是减少癌的发生最可行的方法。研究证明,癌的发生至少经过三个阶段,即始发(initiation)、促癌(promotion)及演进(progression),对癌的化学预防来说,控制始发及促癌,特别是促癌尤为重要。癌的始发起因于细胞受致癌物的多次攻击,DNA受损伤,细胞发生突变;促癌是不断增生的始发细胞经克隆后连续增殖的过程,一般认为这一阶段历时数年,其生物学变化是可逆的,是癌化学预防的理想靶点。Wa~enberg分类法将癌化学预防药分为阻断剂(blockingagents)、阻抑剂(suppressingagent)及致癌物形成抑制剂三大类。阻抑剂中包括癌基因表达抑制剂和DNA氧化损伤抑制剂等。我们已经报道过三物白散加味方体外直接用药可诱导人胃癌SGC 7901细胞凋亡、降低人胃癌SGC 7901细胞P53,Bcl-2,rasP21,CD44基因表达率[1,2],本实验进行了三物白散加味方抗变、抑制rasP21癌基因表达、抗氧化三项研究。
1 实验材料
1.1 实验瘤株及动物 ICR小鼠:体重20~22 g,雌性,由南京中医药大学实验动物中心提供; 人胃癌SGC 7901细胞株:购自中国科学院上海细胞生物研究所。
1.2 实验试剂和仪器 环磷酰胺:三健牌,上海华联制药有限公司,批号971107; 流式细胞仪:BECTON Dickinson USA 公司产品,型号:FACS Calibur; SOD测定试剂盒:购自南京建成生物工程研究所,批号981122。
1.3 药物制备三物白散加味方由巴豆霜(含10%油)、贝母、桔梗、地鳖虫、莪术、参三七、生苡仁、全蝎、木香、炒白芍、甘草等组成,所需药材均购自南京市医药公司,并经本校药物鉴定室鉴定,确定其科属符合实验要求。如巴豆为大戟科巴豆属植物巴豆Croton tiglium L的种子;桔梗为桔梗科桔梗属植物桔梗Platycodon grandiflorum (Jacq) DC.干燥根的切片;浙贝母为百合科植物浙贝母Fritillaria verticillata willdvar.的干燥鳞茎。为实验需要,制成口服混悬液,步骤如下:将其中含挥发油药材在蒸煮时用水蒸汽蒸馏法分离,部分药材经粉碎后用80目筛充分混匀,其余药材煎煮2次,浓缩至小体积,再将小体积煎液与细粉、挥发油混合,并用0.5%羧甲基纤维(CMC)调节成0.5 g/ml 生药浓度的口服混悬液熔封于玻璃安瓿内,灭菌后冷藏备用。
1.4 含药血清制备(1)实验动物 日本大耳白家兔8只,雌雄兼用,体重(2.5±0.2)kg,由南京中医药大学动物实验中心提供;(2)血清制备 日本大耳白家兔随机分为4组,即小、中、大剂量组和对照组,每组2只,小、中、大剂量组分别给予三物白散加味方0.21, 0.63,2.1 g/d灌胃,对照组给予生理盐水灌胃,连续3 d,末次灌胃后2 h,心脏采血,无菌分离血清,经56℃、30 min灭活处理后,用0.22μm微孔过滤除菌,置 20℃保存备用。
2 实验方法
2.1 抗变检测实验用ICR纯种小鼠随机分组,每组5只,并设阴性及阳性对照组,实验组连续l0 d灌胃给药,分3个剂量组灌胃,即三物白散加味方小剂量组(7.65 g・kg 1・d 1)、中剂量组(15.30 g・kg 1・d 1)、大剂量组(30.60 g・kg 1・d 1),阴性及阳性对照组灌蒸馏水0.4 ml/只/d,均连续10 d灌胃。实验组及阳性对照组于灌胃第9天用公认的诱变剂环磷酰胺腹腔注射40 mg/kg,第10天脱臼处死,取骨髓进行MN常规制片。
MN制片:骨髓细胞置NS中,去上清液,加37℃预温的0.4%的KCl置37℃条件下8 min后加入固定液(甲醇∶冰醋酸为3∶1)l ml预固定,离心后去上清液,再加入固定液4 ml混匀,然后气干法滴片,用pH为6.4的10%Giemsa液染色15 min,每个标本统计1 000个细胞,计算出微核率。
比较实验组与实验对照组微核率,若有显著差异,则表明有抗变作用。每组观察细胞数为5 000。
2.2 含药血清对人胃癌SGC 7901细胞超氧化物歧化酶(SOD)活力的影响 取对数生长期人胃癌SGC 7901细胞,0.25%胰酶消化,用培养液配成1×106/ml 的细胞悬液,将三物白散加味方小、中、大剂量组的血清以10%浓度加入,作用20 h后各取100μl按照SOD测定试剂盒的要求进行检测。
2.3 影响rasP21基因表达以0.25%胰酶消化、收集各治疗组血清和空白对照组血清作用20 h的贴壁细胞,以Hank"s、PBS分别洗涤,去上清液,取100 μl加10 μl rasP21单抗混匀,室温闭光反应20 min,离心1 500 r/min,10 min,去上清,用PBS洗1遍,加0.5 ml生理盐水稀释,混匀,上机检测。对照组不加rasP21抗体,其余步骤均相同。
测定后以分析软件CELL Quset分析rasP21基因表达。
3 结果
3.1 抗变结果三物白散加味方抗变结果见表1。
由表1可见,三物白散加味方中、大剂量组有抗变作用,而小剂量无抗变作用。
表1 三物白散加味方抗变结果(略)
与阴性对照组比较,★P<0.05
3.2 含药血清对人胃癌SGC 7901细胞超氧化物歧化酶(SOD)活力的影响结果三物白散加味方含药血清对人胃癌SGC 7901细胞SOD活力的影响实验结果见表2。
表2 三物白散加味方含药血清对人胃癌SGC 7901细胞SOD活力的影响(略)
与对照组比较,★★P<0.01
从表2可见,含药血清治疗小剂量组能明显提高人胃癌SGC 7901细胞SOD活力,而含药血清治疗中、大剂量组则能明显降低人胃癌SGC 7901细胞SOD活力。
3.3 影响rasP21基因表达三物白散味方含药血清对SGC 7901细胞rasP21基因表达的影响结果见表3。
表3 三物白散加味方含药血清对人胃癌SGC 7901细胞rasP21基因表达的影响(略)
与对照组比较,★★P<0.01
从表3可以看出,三物白散加味方含药血清中、大剂量组可以降低人胃癌SGC 7901细胞rasP21基因表达率,而小剂量组作用不明显。
4 讨论
微核(Micronucleus,MN)是检测诱变剂和抗变剂灵敏而且可靠的细胞整体方法。哺乳动物正常在有丝分裂后期染色体逐渐向赤道两极移动,并在末期成为两个子细胞的核心。细胞受化学诱变剂作用后,染色体受损伤而发生断裂,丧失着丝点的染色体断片或染色单体断片在细胞分裂后期,染色体移向纺锤体两极时,这些断片便遗落在细胞质中,分裂末期之后单独形成一至几个小核,此即微核[3]。微核的形成证明染色体受损较严重,若与正常对照组比较有统计学差异则证明有诱变剂存在。再使用环磷酰胺作为实验对象,实验组也使用等量的环磷酰胺并加入所试物,二者相比有统计学差异则证明此物具有抗变效应。本研究采用微核为检测指标,从整体动物水平观察三物白散加味方给药后反应,并与相同剂量环磷酰胺染毒动物微核率作比较,推测三物白散加味方对遭受化学诱变剂影响动物染色体的保护作用,以确定三物白散加味方是否具有癌化学预防的作用。
三物白散加味方主要由三物白散(巴豆、桔梗、贝母)加味而成、据研究报道,巴豆既有抗肿瘤作用又有促肿瘤发生作用[4]。三物白散加味方将巴豆炮制为巴豆霜,降低了毒性,缓和了泻下作用,从本实验的结果来看,三物白散加味方中、高剂量组有抗变作用,而三物白散加味方小剂量组无抗变作用。说明三物白散加味方不但可用于肿瘤的临床治疗,而且临床常用量还具有癌化学预防的作用。
SOD对机体的氧化与抗氧化平衡起着重要的作用,此酶能清除超氧阴离子自由基、保护细胞免受损伤。因而SOD活力的高低与衰老、肿瘤、炎症、自身免疫病、血液病、心血管病等有着密切的关系,对疾病的病因学探讨、诊断、治疗、术后的观察有着重要的意义。
我们的实验结果与以往报道的抗癌中药对自由基的影响不同。据报道,六种抗癌中药单方及复方在试管内的清除自由基活性强度呈量效关系,随着剂量增加而SOD活力增加,从而认为抗癌中药的作用机理与西药不同,主要不是通过活性氧及自由基而发挥作用,而是具有清除自由基作用[5,6]。本实验结果表明,三物白散加味方含药血清对人胃癌SGC 7901细胞SOD活力的影响是含药血清治疗小剂量组能明显提高人胃癌SGC 7901细胞SOD活力,具有抗氧化作用,故小剂量组具有癌化学预防作用;而含药血清治疗中、大剂量组则能明显降低人胃癌SGC 7901细胞SOD活力。目前研究认为,细胞内的氧应激态(oxidative stress)与细胞凋亡的发生密切相关,因而氧自由基、促进活性氧产生的物质以及抑制抗氧化物产生的物质,均可用于细胞凋亡的诱导。三物白散加味方含药血清中、大剂量组能明显降低人胃癌SGC 7901细胞SOD活力,可使自由基含量增加而诱导细胞凋亡,并且, 自由基本身对肿瘤细胞也有杀伤作用。本研究结果提示,三物白散加味方小剂量组具有癌化学预防作用,中、大剂量组降低人胃癌SGC 7901细胞SOD活力也是三物白散加味方抗肿瘤的机制之一。
ras癌基因族有三个主要成员:ki ras,N-ras,Ha ras。它们是一组编码密切相关的蛋白质,含有188~189个氨基酸,相对分子质量为21 000,故又称rasP21。P21能与鸟苷三磷酸(GTP)结合,具有GTP酶活性,能传递生长信号,是调节正常细胞生长和分泌不可缺少的中介物,并在细胞癌变和恶性表型的维持中起重要作用[7]。
目前认为,癌症的发生与癌基因的异常活化及表达有关,用化学物质阻断癌基因的活化及表达,有可能控制癌症的发生,也是癌症预防的一条途径。哺乳动物细胞中的ras癌基因编码一种GTP结合蛋白,由于其第12、13或61位密码子蛋白的ras癌基因的点突变使得它有转化哺乳动物细胞的能力。ras癌基因的点突变常发生在许多人体肿瘤如胰腺癌、结肠癌、肺腺癌等,充分说明rasP21蛋白在人体肿瘤发生过程中的重要性。故可能通过此途径控制癌症的发生和发展,也即具有癌化学预防作用。
另外,目前研究报道,rasP21基因的表达与胃癌淋巴结转移率密切相关,表达率随胃癌临床病程的进展而逐渐增高,故认为ras基因突变可作为胃癌临床判断预后的重要指标[21,22]。另外,动物实验表明,将ras基因转移至适当的肿瘤细胞,可诱导出具有自发性转移能力的转移表型。ras基因促进浸润转移的机制可能与促进细胞产生降解酶,增强对各种生长因子和迁移因子的反应有关。因此,rasP21的表达增强是胃癌恶性程度较高的表现之一,故降低rasP21的表达也可降低胃癌恶性程度。
本研究结果显示,三物白散加味方三个剂量组均有抗变作用;小剂量组有抗氧化作用;中、大剂量组有降低癌基因表达作用,故认为本制剂具有癌化学预防作用。
参考文献:
[1] 徐 力,王明艳,许冬青,等.康尔爱片诱导人胃腺癌SGC 7901细胞凋亡及对P53基因表达影响的研究[J].南京中医药大学学报,1999,15(6):457.
[2] 徐 力,王明艳,许冬青,等.三物白散加味方影响胃癌相关基因表达的实验研究[J].南京中医药大学学报,2002,18(3):158 158.
[3] 汪 谦 . 现代医学实验方法[M].北京:人民卫生出版社,1998:385 385.
[4] 国家中医药管理局中华本草编委会. 中华本草[M].上海:上海科技出版社,1998:950 950.
[5] 王 钢.自由基与中医中药[M].南京:南京大学出版社,1993:243 243.
[6] 莫 简. 医用自由基生物学导论[M].北京:人民卫生出版社,1989:83 83.
[7] 曹世龙 . 肿瘤学新理论与新技术[M].上海:上海科技教育出版社,1997:276 276,752 752.
基金项目:江苏省教育厅自然科学基金资助项目(No.98KJB360006)
(南京中医药大学,江苏 南京 210029)