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       【关键词】  化痰降气胶囊
       摘要：目的：探讨化痰降气胶囊对实验性慢性阻塞性肺疾病治疗作用的内在机理。方法：采用经鼻腔注入肺炎克雷伯杆菌反复感染复制慢性阻塞性肺疾病模型大鼠，实验分为对照组、模型组和化痰降气胶囊组。并用酶联吸附实验(ELISA)方法，测定各组大鼠支气管灌洗液肿瘤坏死因子（TNFα）、白三烯（LTB4）水平。结果：模型组支气管灌洗液TNFα，LTB4水平较正常组显著升高(P＜0.01)；化痰降气胶囊组支气管灌洗液TNFα，LTB4水平均明显降低(P＜0.05)。结论：化痰降气胶囊可降低TNFα，LTB4的含量，控制慢性炎症反应。
       关键词：化痰降气胶囊；慢性阻塞性肺疾病；肿瘤坏死因子α；白三烯；大鼠
       Effect on the Level of TNFα, LTB4 in Bronchoalveolar Lavage Fluid of Model Rats with Chronic Obstructive Pulmonary Disease by Huatanjiangqi Capsule
       LI Zegeng， ZHANG Jiegen， PENG Bo， ZHANG Nianzhi， HAN Mingxiang
       (The First Hospital Affiliated to Anhui College of Traditional Chinese Medicine, Anhui Hefei, 230031 China)
       Abstract:Objective:To observe the effects of Huatanjiangqi Capsule, a combination of traditional Chinese medical herbs on the changes of TNFα,LTB4 in Bronchoalveolar Lavage Fluid, in order to provide basis for the explanation of the mechanisms of Huatanjiangqi Capsule and discover it"s pathophysiological characters.Methods:According to the principle of random, 36 Wistar rats(male)were divided into control group, model group and Huatanjiangqi Capsule group. model group was established by repeatedly intranasal infecting of klebsiella pneumoniae twice a week. TNFα，LTB4 in bronchoalvolar lavage fluid of three groups were measured by ELISA.Results:TNFα,LTB4 in bronchoalveolar lavage fluid of model group were significantly higher than in control group(P＜0.01), and the level of TNFα,LTB4 of Huatanjiangqi Capsule group were lower than those of the model group(P＜0.05).Conclusion:Huatanjiangqi Capsule could relieve the clinical symptoms and major injury of lung induced by superexcretion of inflame cytokine through dereasing the levels of TNFα,LTB4 in the rats with Chronic Obstructive Pulmonary Disease.
       Key words:Huatanjiangqi Capsule; Chronic Obstructive Pulmonary Disease(COPD);       Tumor Necrosis Factor alpha(TNFα); Leukotrienes B4(LTB4); Rats
             
　　化痰降气胶囊系经多年临床实践筛选出的治疗慢性支气管炎验方。 肿瘤坏死因子（TNFα）、白三烯（LTB4）是参与炎症反应的主要细胞因子之一，在慢性阻塞性肺疾病(COPD)的发病过程中起着关键作用［1］。为了进一步探讨化痰降气胶囊对慢性阻塞性肺疾病的作用机理，我们观察了其对慢性阻塞性肺疾病大鼠支气管灌洗液(BALF) TNFα，LTB4水平的影响。
       　1 材料和方法
       1.1　细菌肺炎克雷伯杆菌由安徽医科大学第一附属医院微生物室提供，是从COPD患者痰液中分离、鉴定，使用前接种于普通牛肉汤培养基内，置37℃恒温箱内增殖48 h，用无菌生理盐水稀释适当浓度并计数为6×108 CFU/ml(经预实验确定)。
       1.2 药物化痰降气胶囊由紫苏子、白芥子、金沸草、白前等中药组成，由安徽中医学院第一附属医院制剂室提供。
       1.3 实验动物与分组清洁级雄性Wistar大鼠36只，质量为(200±20) g，河南医科大学实验动物中心提供。动物饲养室为清洁级，控制温度(22±2)℃，正常饲养7 d后进行实验。随机分为正常对照组(对照组)、慢性阻塞性肺疾病模型组(模型组)，化痰降气胶囊组，每组12只。模型组：采用经鼻腔注入肺炎克雷伯杆菌反复感染复制慢性阻塞性肺疾病模型，方法：经鼻腔注入该菌菌液0.1 ml，2次/周，持续8周［1］；化痰降气胶囊组：灌胃治疗(剂量每鼠4粒/d，溶于1 ml生理盐水中)，在大鼠经鼻染菌满4周时进行；对照组：正常饲养，大鼠经鼻腔注入常规培养液0.1 ml(不含菌)，2次/周，持续8周。
       1.4  观察指标与测试
       1.4.1 支气管灌洗大鼠用3%戊巴比妥钠(30 mg/kg)腹腔麻醉后，迅速用器械分离气管，用10 ml生理盐水进行在体肺泡灌洗，缓慢的经气道把液体注入肺脏，再回抽液体，如此反复进行3次，最终回收量为6 ml，4℃ 1 500 r/min离心5 min，提取上清液，20℃冻存待检。离心细胞再用生理盐水洗涤后，用血细胞计数板做细胞计数。
       1.4.2　指标测定 TNFα，LTB4试剂来自TPI.INC。TNFα，LTB4测定采用ELISA法，均按说明书操作。
       1.5 统计方法实验数据以均数(±s)表示，组间比较用t检验。应用SPSS11.0软件进行处理。
       　　2  结果
       2.1 支气管灌洗液白细胞总数和分数计数见表1。模型组BALF白细胞计数明显高于对照组(P＜0.01)，模型组BALF中巨噬细胞百分比虽低于对照组，但其绝对值(41.2×107 L)明显高于对照组(15.1×107 L)；化痰降气胶囊组BALF白细胞计数同对照组相比也有明显差异，但其值同模型组相比则明显下降。
2.2       支气管灌洗液LTB4,TNFα的含量见表2。模型组BALF中LTB4，TNFα含量明显高于对照组(P＜0.01)；而化痰降气胶囊组LTB4，TNFα含量同模型组相比明显下降，但与对照组比较仍有差异(P＜0.05)。表1 各组大鼠支气管灌洗液白细胞计数及分类比较(略)表2 各组大鼠支气管灌洗液LTB4、TNFα的含量比较(略)
       3  讨论
       目前普遍认为，COPD是以气道、肺实质和肺血管的慢性炎症为特征，在肺的不同部位有肺泡巨噬细胞、T淋巴细胞和中性粒细胞增加，激活的炎症细胞释放多种介质 ，这些介质破坏肺的结构和促进中性粒细胞炎症反应。COPD的各种危险因素都可以产生类似的炎症过程，从而导致COPD的发生［2］。COPD是存在不完全可逆性的气流受限性疾病，其气流受限存在进行性发展和伴肺部炎症的特性。近年来的研究提示COPD亦是一种慢性气道非特异性炎性疾病，部分患者具有气道高反应性［3］。
       许多研究已证实，TNFα在COPD患者血液、痰液、支气管肺泡灌洗液及肺组织中是升高的，且与COPD患者的静息能量消耗增加，恶液质形成和预后不良有关。中性粒细胞、巨噬细胞和T淋细胞是COPD肺组织、支气管肺泡灌洗液和痰中的主要炎症细胞，可能在机体局部防御反应中起重要作用，但它们亦产生包括TNFα在内的多种炎症介质，当其大量产生时，产生对机体有害的反应。TNFα具有多种前炎症介质的功能，包括促进中性粒细胞颗粒伴蛋白水解酶释放和呼吸爆发。吸烟等多种COPD危险因素导致支气管上皮细胞受损，组织或肺泡在巨噬细胞和上皮细胞分泌TNFα，促进炎症细胞趋化和活化，导致气道结构破坏。在动物实验中，TNFα可诱导气道粘液细胞化生和分泌过多，导致大鼠肺气肿性损害和肺泡壁胶原沉积［4］。故TNFα可诱导细胞死亡和肺气肿，破坏清除功能(杯状细胞代替纤毛细胞)，与临床COPD所见有关。目前认为气道炎症在COPD急性发作期起重要作用，在致病因素作用下，炎症细胞在气管壁和肺泡大量聚积，其中肺巨噬细胞释放TNFα、IL1β等，诱发上皮细胞释放大量炎性介质，造成病理损害［5］。前炎性细胞因子(TNFα、IL1等)与抑炎性细胞因子(IL10等)共同参与炎症反应的过程。TNFα在疾病早期可促进IL10 mRNA的产生，导致IL10浓度升高，以减少组织损伤，起到抗炎作用。
       白三烯(LTs)是一组炎性递质，它是由花生四烯酸(AA)经5脂氧酶代谢生成的一簇产物，人的肺脏细胞及炎症细胞含有丰富的脂氧酶，是LT的重要组织来源。LTs包括LTB4和CysLT(LTC4、LTD4、LTE4)，这类炎症递质与许多炎性疾病如支气管哮喘、COPD等密切相关［6］。LTB4为最强的细胞趋化剂，可引起炎症细胞包括中性粒细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞和淋巴细胞等聚集和激活，所以血清LTB4含量在一定程度上也反映了气道炎症反应的程度，炎症反应越强，白细胞和巨噬细胞释放的蛋白分解酶也越多［7］。LTB4是引起气道变应性炎症的主要介质，是目前已知最强的中性粒细胞催化因子和活化因子之一［8］。LTB4亦介导内皮细胞和多型核白细胞表面粘附蛋白的表达，促进炎性细胞的渗出及迁移。自1984年O’Driscoll等［9］发现COPD患者痰中LTB4浓度增高以后，许多研究人员得出了与此相同的结论。Seggev等［10］发现COPD患者痰中LTB4浓度不仅高于正常人，亦高于哮喘患者。最近的文献报道表明，COPD急发期和缓解期患者痰中LTB4均增高［11，12］，上述研究结果提示白三烯与COPD有密切的关系。为进一步证明LTs与COPD的关系，Mitsunobu等［3］对COPD患者外周血白细胞产生LTB4和LTC4的情况进行研究，不仅发现COPD患者外周白细胞产生LTB4和LTC4明显增多，且LTB4和LTC4水平的增多与患者FEV1的下降呈明显负相关关系，特别是与体内存在IgE抗体的COPD患者的FEV1降低有关，提示外周血白细胞产生LTs量和气道阻塞有显著的相关关系。COPD患者缓解期、急发期痰中中性粒细胞增高，中性粒细胞激活时产生大量LTB4，LTB4是强有力的中性粒细胞和嗜酸粒细胞的趋化剂和激活剂，而且中性粒细胞表面有高浓度的LTB4受体，这些特点导致中性粒细胞通过产生LTB4形成自分泌刺激，从而引起炎症扩大，炎症持续。慢性气道炎症是COPD重要的发病机制之一，白三烯作为强有力的炎症介质与COPD的发生发展有着密切的关系。
       化痰降气胶囊具有化痰降气，止咳平喘等功效，该方由白芥子、紫苏子、白前、金沸草等组成，适用于慢性阻塞性肺疾病急性发作期和缓解期。紫苏子降肺中逆气，为降气平喘要药，而紫苏子和白芥子具有抗炎杀菌作用；金沸草、紫苏子、白前三味，皆具“温而不燥，润而不腻”之性，功擅温润肺气，止咳化痰，为治疗久咳久喘之良药。诸药合用，共收化痰降气、宣肺止咳平喘抗炎之效。化痰降气胶囊能减轻COPD炎症和改善支气管病理损伤，其治疗CDPD的部分机制是否与调低COPD气道TNFα和LTB4，从而减轻支气管炎症是本次实验的重点。本实验的结果显示，化痰降气胶囊确能降低COPD模型大鼠支气管肺泡灌洗液中TNFα、LTB4，从而减少中性粒细胞向气道中趋化，减轻气道炎症及其所造成的支气管肺组织损伤。
       目前尚无治疗COPD气道炎症的特效药物，因此，研究相关制剂，提高COPD气道炎症防治水平，具有重要意义。本实验的结果为研究治疗COPD等气道炎症疾病有效中药复方制剂提供了一定的实验依据。
       　　参考文献：
       ［1］许浒，熊密，车东媛，等.中药814对肺炎克雷伯杆菌诱发大鼠慢性阻塞性肺疾病的影响［J］.同济医科大学学报，1999，28(5)：375380.
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       ［9］O’ Driscoll BR， Cromwell O，Kay AB. Sputum leukotrienes in obstructive airways disease［J］.Clin Exp Immunol，1984，55：397404.
       ［10］Seggev JS， Thornton WH Jr， Edes TE. Serum leukotrient B4 levels in patients with obstructive pulmonary disease［J］.Chest ，1991，99：289291.
       ［11］Crooks SW, Bayley DL, Hill Sl, et al. Bronchial inflammation in acute bacterial exacerbations of chronic bronchitis: the role of lukotriene B4［J］.Eur Respir J,2000,15:274280.
       ［12］Hill AT， Bayley D. The interrelationship of sputum inflammatory markers in patients with chronic bronchitis［J］.Am J Respir Crit Care Med，1999，160：893898.
       基金项目：国家中医药管理局新药开发资助项目(No.DZX031A)
       作者简介：李泽庚(1962)，男(汉族)，安徽桐城人，现任安徽中医学院第一附属医院呼吸科副主任医师，硕士生导师，硕士学位，主要从事中医药防治呼吸病的研究.
       (安徽中医学院第一附属医院，安徽 合肥230031)
       收稿日期：20050310