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       【摘要】 
       目的探讨姜黄素（CMN）抗顺铂所致大鼠肾损害的作用及其机制。方法选择48只雄性Wistar大鼠，随机分为Ⅰ（n=12），Ⅱ（n=6），Ⅲ（n=6），Ⅳ（n=12）,Ⅴ（n=12）组，分别行第1次腹腔注射：生理盐水（Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ组）、CMN 30 mg/kg（Ⅳ组）、CMN 30 mg/kg+锌原卟啉Ⅸ（ZnPPⅨ）10 mg/kg（Ⅴ组），8 h后，从Ⅰ，Ⅳ，Ⅴ组中各任选6只鼠处死，检测HO1蛋白表达与活力。余鼠再行第2次腹腔注射：生理盐水（Ⅰ组），CMN 20 mg/kg+顺铂6 mg/kg（Ⅱ组）。顺铂6 mg/kg（Ⅱ，Ⅳ，Ⅴ组），5 d后处死，检测血肌酐（Cr）、尿素氮（BUN）、肾脏系数、肾组织超氧化物歧化酶（SOD）活力及谷胱甘肽（GSH）和丙二醛（MDA）含量。结果顺铂可明显升高肾组织氧化应激水平并严重损伤肾脏的结构和功能，姜黄素仅有较弱的直接抗顺铂肾毒性作用，但用姜黄素预处理上调HO1蛋白表达及活力能显著增强其抗顺铂肾毒性作用；反之，用ZnPPⅨ抑制HO1活力则可消除姜黄素抗顺铂肾毒性作用。结论 姜黄素主要通过上调HO1蛋白表达有效拮抗顺铂所致的氧化应激性肾损伤。
       【关键词】  顺铂； 姜黄素； 血红素氧合酶1； 氧化应激； 肾毒性
       Study on the Protective Effect and Mechanism of Curcumin on Cisplatininduced Nephrotoxicity
       ZHANG Ying, HUANG Weiyi, WANG Shunrong ,CHEN Rong
       
       (Luzhou Medical College, 646000, China; The Affiliated Hospital of Luzhou Medical College, 646000, China)
       Abstract：Objective To investigate the protective effects of curcumin(CMN) on cisplatininduced nephrotoxicity in rats and the possible mechanisms. Methods48 male wistar rats were randomly divided into 5 groups：groupI(n=12),groupII(n=6), groupIII(n=6),groupIV(n=12),groupV(n=12).Rats received intraperitoneally injection for the first time respectively with saline(groupI, groupII, groupIII),CMN 30 mg/kg (groupIV),CMN 30 mg/kg+Zinc protoporphyrin IX(ZnPPIX) 10 mg/kg(groupV).8 hours later，half rats in group I,groupIV,groupV were killed to analyse renal HO1 protein express and activity.Other rats received the intraparitoneally injection for the second time respectively with saline(groupI),Cisplatin 6mg/kg+CMN 30 mg/kg(groupIII) and cisplatin 6 mg/kg(groupII, groupIV, groupV).5 days later,all the animals were killed to measure the blood creatinin(Cr), urea nitrogen(BUN) and analyse the renal superoxide dismutase(SOD) activity, glulathion(GSH) and malondialdehyde(MDA) content and histopathological lesion.ResultsCisplatin could increase the renal oxidative stress level and damage seriously the renal histology construction and function.CMN only has slight direct protective effect against the cisplatin-induced nephrotoxicity.But the renal protective effect would increased significantly by pretreatment with CMN to upregulate renal HO1 protein level and considerably attenuated by inhibiting HO1 protein activity with ZnPPⅨ.ConclusionCMN can protect against cisplatininduced oxidative stress renal injury by inducing HO1.
       Key words：Cisplatin；  Curcumin；  Heme oxygenase1；  Oxidative stress；  Nephrotoxicity
       
       顺铂是当前临床上最常用的抗肿瘤药物之一，在诸如肺癌、膀胱癌、睾丸癌和卵巢癌等十余种肿瘤中被推荐为首选化疗药，但顺铂明显的肾毒性很大程度上限制了其在临床的应用。近年有研究报道，姜黄素（curcumin，CMN）能有效防止顺铂所致的急性肾损伤，但其作用机制尚未完全阐明［1］。鉴于顺铂主要是通过促进自由基生成致使肾脏遭受氧化应激性损伤［2］，而血红素氧合酶1（HO1）则是细胞应对各种氧化应激损伤最重要的内源性保护因子，因此，我们推测CMN有可能是通过诱导HO1表达发挥抗顺铂的肾毒性作用，但迄今尚未见国内外有相关的研究报道。本文拟对此作一探讨。
       1  材料与方法
       1.1  药品与试剂顺铂为云南个旧生物药业有限公司产品，批号：060701。锌原卟啉Ⅸ（ZnPPⅨ）及CMN购于Sigma公司。肌酐（Cr）、尿素氮（BUN）、超氧化物歧化酶（SOD）及蛋白定量检测试剂盒购于南京建成生物工程研究所。HO1免疫组化检测抗体及试剂购于武汉博士德公司。
       1.2  动物分组及处理选择健康雄性Wistar大鼠48只，体重185～230 g，随机分为5组：Ⅰ组（对照组，n=12）、Ⅱ组（单纯顺铂组，n=6），Ⅲ组（CMN组，n=6）、Ⅳ组（CMN预处理组，n=12），Ⅴ组（HO1抑制组，n=12）。分别第1次经腹腔注射等容积生理盐水（Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ组），CMN 30 mg/kg（Ⅳ组），CMN 30 mg/kg+ZnPPⅨ 10 mg/kg（Ⅴ组），8 h后，从Ⅰ，Ⅳ，Ⅴ3组中各任挑6只大鼠处死取肾检测HO1蛋白表达与活力。其余大鼠再分别第2次经腹腔注射生理盐水（Ⅰ组），CMN 30 mg/kg+顺铂6 mg/kg（Ⅲ组），顺铂6 mg/kg（Ⅱ，Ⅳ，Ⅴ组）。动物如平常自由进食摄水，5 d后称重、处死，取血及肾检测各项指标。
       1.3   指标检测
       1.3.1   HO1的检测采用SABC法检测肾组织内HO1蛋白表达。肾组织用10%中性福尔马林液固定，石蜡包埋、切片，切片常规脱蜡、至水，3%H2O2灭活内源性过氧化酶，经抗原修复、正常血清封闭后，滴加Ⅰ抗（抗HO1抗体，滴度1:200）及Ⅱ抗（滴度1∶100），DAB室温避光显色，脱水、透明、封片，显微镜下观察，见胞浆有棕褐色颗粒者为HO1阳性表达细胞，用CD8病理彩色图像分析系统在200倍光镜下，对每张切片随机测定10个不重复视野的肾小管上皮细胞HO1蛋白光密度值，取平均值代表HO1蛋白表达量。
       
       HO1活力测定参考姚海木［3］的方法进行，即取肾组织约0.5 g，制成10%组织匀浆，高速离心分离微粒体，考马亮兰法定量蛋白浓度，再根据HO1降解血红素生成胆红素的原理，通过测定反应体系中胆红素的生成量代表HO1活力，单位为 nmol/(mg蛋白·h)。
       1.3.2  血Cr，BUN及肾组织生化指标测定按试剂盒说明书分别采用苦味酸法、二乙酰法测定血Cr，BUN。称双肾重量，以每100 g体重对应的肾脏重量表示肾脏系数。取肾皮质约1 g制成组织匀浆，按试剂盒说明书操作步骤测定SOD活力（黄嘌呤氧化酶法）、GSH（二硫代对硝基苯法）及MDA含量（硫代巴比妥法）。
       1.4  组织病理学检查取小块肾组织置于10%中性福尔马林液中固定，常规酒精、二甲基苯脱水，石蜡包埋、切片，HE染色，光镜下观察组织形态学改变。
       1.5  统计学分析本实验所得数据均为计量资料，以(±s)表示，组间比较采用F+q检验，用SPSS11.0统计软件完成。
       2  结果
       2.1  肾组织HO1蛋白表达量及活力变化免疫组化分析显示，HO1蛋白主要表达于肾小管上皮细胞胞浆内，其中Ⅰ组代表基础状态，显示大鼠肾内HO1蛋白表达量及活力均较低。Ⅱ，Ⅲ组虽未检测，但因预处理方法同Ⅰ组，故其HO1蛋白表达量及活力应与Ⅰ组相同。Ⅳ组显示CMN预处理显著上调了肾内HO1蛋白表达量及活力。Ⅴ组显示ZnPPⅨ部分抑制了CMN诱导HO1蛋白的表达量并显著抑制了HO1活力。见图1及表1。
       表1  HO1蛋白表达量及活力的比较（略）
       与Ⅰ组比较，*P<0.01；与Ⅳ组比较，▲P<0.01；n=6
       2.2  血和肾组织生化指标的变化与Ⅰ组相比，Ⅱ组单用顺铂使肾脏系数明显增加，血Cr，BUN明显升高，肾组织SOD活力及GSH含量显著下降，而MDA含量显著增加；Ⅲ组显示与顺铂同时合用CMN，上述指标的变化与Ⅱ组类似但程度稍轻，Ⅳ组显示用CMN预处理，上述指标的变化较Ⅱ组显著减轻；Ⅴ组显示用ZnPPⅨ+CMN预处理，上述指标的变化又与Ⅱ组相似，而较Ⅳ组显著。见表2。
       表2  肾脏系数、血及肾组织生化指标的比较（略）
       与Ⅰ组比较，*P<0.05，**P<0.01；与Ⅱ组比较；#P<0.05，##P<0.01；n=6
       2.3   肾组织病理学变化Ⅰ组显示肾小球及肾小管结构清晰，无细胞肿胀及坏死脱落。Ⅱ组显示肾组织结构严重损伤，表现为肾小球充血，肾小管特别是近端小管上皮细胞明显浊肿，片状坏死、脱落，间质炎细胞浸润，管腔内有明显蛋白、细胞管型。Ⅲ组改变与Ⅱ组类似，但程度稍轻。Ⅳ组病理改变显著减轻，肾小球及肾小管结构基本正常，仅皮髓交界处小管细胞轻度肿胀，偶见坏死、脱落细胞，管型和炎细胞浸润均不明显；Ⅴ组则与Ⅱ组病变程度相似，也主要是肾小管严重受损，小管细胞明显肿胀、坏死、脱落，管腔内出现大量管型等。
       3  讨论
       
       顺铂是以2价铂为中心，同2个氯原子和2个氨基结合而成的重金属化合物，其亲核氨基可与水分子作用产生大量的自由基，造成线粒体和细胞膜等氧化应激性损伤。另外，顺铂还可诱导一氧化氮合酶活性升高，促进NO生成，后者既可与超氧化物阴离反应成大量羟自由基，又可使蛋白中的酪氨酸硝基化，从而抑制SOD活力，加重细胞损伤［4］。我们采用一次性注射大剂量顺铂的方式，成功诱导了急性肾损伤大鼠模型，表现为肾功能衰竭，肾小管上皮细胞浊肿、坏死和脱落等病理改变，检测肾组织内SOD活力及GSH含量降低而MDA含量明显升高，证明顺铂主要通过氧化应激的方式损伤肾脏，从而为顺铂肾毒性的防治确定了靶标。
       
       已知CMN是从植物姜黄中提取的天然色素，也是姜黄的主要药用成分，其实质是一种生物多酚化合物。现代医学研究揭示，CMN具有直接捕捉和清除自由基的能力，其分子结构中的酚羟基在抗氧化活性中起决定作用［5］。但近期发现，CMN更是一个强有力的HO1诱导剂，CMN的抗氧化作用可能更主要依赖于对HO1蛋白的诱导表达［6］。因为特异性阻断HO1活性，即可显著削弱CMN的抗氧化能力及其细胞保护功能［7］。本研究显示，CMN与顺铂同时应用，其直接抗肾损伤作用较弱，但当预先应用CMN诱导肾小管上皮细胞内HO-1蛋白表达及活性升高后，则可显著抑制随后应用顺铂导致的肾损伤，使肾组织病理学改变及肾功能均得到极大改善，而用ZnPPⅨ特异性阻断HO1蛋白表达与活性时，CMN的上述抗顺铂肾毒性作用被消除，充分说明CMN抗顺铂肾毒性作用机制主要是通过诱导HO1蛋白表达介导的。众多研究揭示，HO1是广泛存在于细胞微粒体内的一种可诱导的抗氧化酶，由特定的理化因素诱导表达，通过催化细胞内游离血红素降解生成重要产物-胆红素与CO等， HO1/胆红素/CO系统具有抗氧化、抗炎、抗凋亡等作用，是细胞应对氧化应激不可或缺的内源性保护体系［8］。本文结果也显示，用CMN预诱导HO1蛋白表达及活性升高后，可显著抑制顺铂引起的肾内氧化应激水平，表现为脂质过氧化产物MDA生成减少，同时，还有效保护了细胞内抗氧化酶SOD的活性及抗氧化物GSH含量，有利于维持细胞内氧化还原状态的平衡，稳定细胞的形态与功能。而用ZnPPⅨ预先阻断CMN对HO1蛋白的诱导，特别是显著抑制HO1蛋白的活性，则会消除上述肾保护效果，表明CMN主要通过诱导HO1蛋白表达介导其抗顺铂肾损伤作用。文献资料显示，CMN可能是通过活化Nrf2/ARE（核因子相关因子/抗氧化剂反应元件）途径诱导HO1基因转录和表达的［9］。本研究结果将为临床合理应用CMN有效防止顺铂的肾毒性提供有力的实验依据。
       【参考文献】
         　　［1］ 李昱辰，仲来福．CMN对顺铂所致大鼠肾毒性的防护作用［J］.毒理学杂志，2006，20(2)：91.
       
       ［2］ 王 黎，裴 瑞，杨红梅，等．顺铂诱导肾损伤过程中肾皮质脂质过氧化的变化［J］.中国应用生理学杂志，2004，20(4)：393.
       
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       ［4］ 严 颖，徐兆发．顺铂肾毒性防治方法的研究进展［J］.日本医学介绍，2003，24(8)：379.
       
       ［5］ Priyadarsini KI, Maity DK, Naik GH, et al. Role of phenolic HO1 and methylene hydrogen on the free radical reactions and antioxidant activity of curcumin［J］.Free Rad Biol Med,2003,35(5)：475.
       
       ［6］ Jeong GS, Oh GS, Pae HO,et al. Comparative effects of curcuminoids on endothelial heme oxygenase-1 expression：orthomethoxy groups are essential to enhance heme oxygenase activity and protection［J］. Exp Mol Med. 2006 ,38(4)：393.
       
       ［7］ Scapagnini G, Colombrita C, Amadio M,et al. Curcumin activates defensive genes and protects neurons against oxidative stress［J］. Antioxid Redox Signal. 2006, 8(3-4): 395.
       
       ［8］ Takahashi T, Morita K, Akagi R, et al. Heme oxygenase-1:a novel therapeutic target in oxidative tissue injuries［J］. Curr Med Chem, 2004, 11(12)：1545.
       
       ［9］ Balogun E, Hoque M, Gong P,et al. Curcumin activates the heme oxygenase-1 gene via regulation of Nrf2 and the antioxidantresponsive element［J］. Biochem J. 2003 ,371(Pt 3)：887.