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       【摘要】 
       目的探讨大蒜素对血液流变性及红细胞生理特性的影响。 方法制作急性高黏滞大鼠模型动脉取血，通过黏度法测定血流变指标及红细胞聚集指数，核孔膜滤过法测定红细胞滤过指数，荧光偏振法测定红细胞膜流动性，以及红细胞渗透脆性试验，比较大蒜素腹腔注射组和未处理组的差异。 结果与未处理组比较，大蒜素高、中、低剂量组对血瘀症大鼠全血黏度的增加均有明显降低作用（P＜0.01，P＜0.05）；中、高剂量组对血浆黏度有明显降低作用（P＜0.05），且上述作用呈现一定的量效关系；高剂量组可明显降低红细胞压积（P＜0.05），可明显提高红细胞的变形性（P＜0.05）；中、低剂量组有降低红细胞聚集性的作用；各剂量组对红细胞渗透脆性的增大有改善作用；各剂量组对红细胞膜流动性的降低有改善作用，但均不具有统计学意义。结论 大蒜素可提高红细胞变形性和降低血液黏度，改善血液流变性，而用于血淤症的防治。
       【关键词】  大蒜素； 急性血淤症； 血液流变性； 红细胞
       Effects of Allicin on Hemorheology and Physiological Properties of Erythrocytes in Acute Blood-stagnated Rats
       LIU Dandan，  SUN Junshe
       （College of Food Science and Nutritional Engineering, Chinese Agricultural University,Beijing,100083，China）
       Abstract:ObjectiveTo explore the effects of allicin on hemorheology and physiological properties of erythrocytes.MethodsWe established the rat models of acute hyperviscosity and collected artery blood samples. Then we examined the hemorheology index and erythrocyte aggregation index by the viscosity methods, detected the erythrocyte filtration index by the nuclear  pore  film, determined erythrocyte membrane fluidity by the fluorescence polarization and performed erythrocyte osmotic fragility test. The difference between the allicin intrapertoneal injection group and the untreatment group was observed.ResultsIn comparison with the untreatment group, all the high-, medium- and low-dose groups of allicin treatment had a decline in the enhancement of whole blood viscosity in rats with blood stasis (P＜0.01, P＜0.05). In the high- and medium-dose groups, the plasma viscosity significantly decreased (P＜0.05) and had the dose-effect relationship. In the high-dose group, the hematocrit greatly decreased  (P＜0.05) and the erythrocyte deformability increased (P＜0.05). In the medium- and low-dose groups, the erythrocyte aggregation index decreased. All dose of allicin had effect on the increase of erythrocyte osmotic fragility and the decrease of erythrocyte membrane fluidity, but no significance was detected. ConclusionAllicin may increase the erythrocyte deformability, decrease the whole blood viscosity and improve the blood rheological properties and it can be used in the treatment of blood stasis.
       Key words:Allicin;    Acute blood stasis ;    Erythrocyte;    Hemorheology
       
       大蒜素(Allicin)具有抗细菌、抗真菌、抗肿瘤和杀虫等作用［1］。近年发现其还有抗病毒、提高免疫功能、清除自由基、抗氧化、降血压、降血脂、抗动脉粥样硬化、降血糖、抗心律失常及收敛作用［2］。目前医学界已将其广泛用于多种疾病的防治。其降压、降脂、抗动脉粥样硬化作用主要表现在对血液流变性的影响，而对血液流变性的研究，多数集中在血小板功能上，对红细胞流变性研究颇少。本文着重研究大蒜素对红细胞流变性等生理特性的影响。
       1  材料
       1.1  动物Wistar大鼠，雌雄兼用，体重(200±20)g，3～4月龄，购自北京海淀通利实验动物养殖中心。
       1.2  药品与试剂大蒜素注射液产自上海禾丰制药有限公司，30 mg/2 ml。
       1.3  主要仪器NXE1型锥板式黏度仪：成都仪器厂产品。DXC300型核孔膜红细胞变形能力测定仪：上海医科大学仪器厂产品。65060荧光偏振仪：日本日立公司产品。微量高速离心机：航空航天部华兴航空机轮公司产品。
       2  方法
       2.1  动物分组及给药实验动物50只，随机平均分为5组：空白对照组（生理盐水2 ml·kg-1·d-1）、急性高黏滞模型组（生理盐水2 ml·kg-1·d-1）、大蒜素低剂量组（5 ml·kg-1·d-1）、大蒜素中剂量组（10 ml·kg-1·d-1）、大蒜素高剂量组（20 ml·kg-1·d-1）。除空白对照组，其余动物每日自来水灌胃5 ml/只，连续7 d，第7天皮下注射浓度为0.1%的肾上腺素0.08 ml/100 g体重，注射2 h后，浸入冰水中5 min，间隔4 h注射第2次，制作急性高黏滞模型［3］。所有动物在造模后的第2天开始每日腹腔注射（ip）相应药物1次，连续用药7 d。
       2.2  血流变指标及红细胞聚集性的测定黏度法［4］。
       2.2.1  采血与抗凝末次给药后2 h，腹腔注射戊巴比妥钠40 mg/kg麻醉。颈动脉采血，肝素20 IU/ml抗凝。
       2.2.2   测定全血黏度及血浆黏度取抗凝血1.3 ml，在37℃，分别测定各血样在切变率230S-1和11.5 S-1时的全血黏度值。2000r/min离心15 min，分离血浆，测定其在115 S-1时的血浆值。
       2.2.3   红细胞压积（Hct）的测定温氏法。用毛细吸管吸取0.5 ml抗凝血，插入温氏压积管底部，使血样至10刻度处止。不要注入气泡。将注入血样的压积管置入离心机管管斗内，以2 300 r/min离心30 min。取出压积管，在白细胞与红细胞分界层面对齐的刻度上读出数值，即为红细胞压积的百分数。
       2.2.4   计算红细胞聚集指数红细胞聚集指数（ηre）定义为
       
       ηre=ηbηpηp×1Hct
       
       其中ηb：低切变率全血黏度；ηp：血浆黏度；Hct：红细胞压积；ηre即为低切变率全血还原黏度，其值取决于低切变率下红细胞的聚集程度，ηre越大，表明红细胞聚集性越强。
       2.3  红细胞变形性的测定核孔膜滤过法［5］。
       2.3.1  红细胞悬浮液的配制取2.2.1抗凝血1.5 ml，3 000 r/min离心10 min，吸出血浆和白细胞，以pH值7.35的PBS缓冲液洗涤3次，均离心去上层液。以上述缓冲液制备10%红细胞悬浮液。
       2.3.2  测定红细胞压积（Hct）方法同2.2.3。
       2.3.3  测定滤过时间红细胞悬浮液在37℃温育，取1ml红细胞悬浮液和PBS缓冲液分别置入红细胞变形仪，测定滤过核孔膜的时间tg，ts。
       2.3.4  计算红细胞滤过指数红细胞滤过指数（IF）定义为：IF=tg-tsts×1Hct，红细胞变形性越差，通过膜孔越困难，其悬浮液滤过的时间tg越长，故滤过指数IF越大，表示红细胞变形能力越差。
       2.4  红细胞渗透脆性试验［5］称取120℃恒重的分析纯NaCl 1.000 g，加少量蒸馏水溶解，于100 ml容量瓶中用蒸馏水定容，得171.1 mmol/L NaCl溶液。取12支试管，加入氯化钠溶液和蒸馏水，配制浓度为41.0，47.9，54.7，61.6，68.4，75.2，82.1，88.9，95.8，102.6，109.4，116.3 mmol/L的NaCl溶液。取颈动脉不抗凝血液1 ml，通过6号针头，针头斜面向上，向以上每管加入1滴血，轻轻摇匀，在室温静置2 h后，观察结果。结果判断时，先从高浓度开始观察，上层溶液开始出现透明红色者为开始溶血管，溶液为透明红色且管底红细胞完全消失者为完全溶血管。分别记录其各自的NaCl浓度。浓度值高于正常对照，表明渗透脆性增大，反之减小。
       2.5  红细胞膜流动性的测定荧光偏振法［6］。
       2.5.1   DPH（1，6二苯基1，3，5乙三烯）溶液配制称取DPH4.05 mg，溶于10 ml四氢呋喃，配成浓度为2×10-3mol/L，以pH值7.35的PBS缓冲液稀释至2×10-6mol/L。
       2.5.2  红细胞悬浮液制备及荧光标记取抗凝血1 ml，按2.3.1方法制备0.4%的红细胞悬浮液，取悬浮液1 ml加入DPH溶液1 ml，25℃温育30 min，3 000 r/min离心4 min，去上层液，以PBS缓冲液洗涤2次，均离心去上层液。加入PBS缓冲液使终体积为2 ml。
       2.5.3   荧光偏振度的测定及计算测定前用0.1 mol/L硫酸奎宁液校正仪器。采用激发波长361 nm，发射波长463 nm，入射和出射狭缝均采用10 nm，当激发光路的偏振片和发射光路的偏振片光轴相互平行时，测得荧光强度为Ⅰ1，当两光轴相互垂直时，测得荧光强度为Ⅰ2。
       
       偏振度（P）＝（Ⅰ1－Ⅰ2）/（Ⅰ1＋Ⅰ2）。偏振度越大，表明红细胞膜流动性越小。
       2.6   统计学处理实验结果均为计数资料，均数以±s表示，统计分析采用方差分析及q检验，等级资料采用秩和检验。
       3   结果
       3.1  大蒜素对红细胞聚集性的影响急性高黏滞模型组与对照组比较，全血高切及低切黏度、血浆黏度、红细胞压积均明显增高（P＜0.01或P＜0.05），提示急性血淤症模型复制成功。与模型组比较，大蒜素高、中、低剂量组对血淤症大鼠全血高切黏度分别降低14.43%（P＜0.01），9.71%（P＜0.01），4.15%（P＜0.05）；对全血低切黏度分别降低15.89%（P＜0.01），14.27%（P＜0.01），6.86%（P＜0.01）；对血浆黏度分别降低11.33%（P＜0.05），9.78%（P＜0.05），3.49%（P＞0.05），且上述作用呈现一定的量效关系。大蒜素高剂量组可明显降低红细胞压积（P＜0.05），降低程度为6.47%；中、低剂量组此作用不明显。大蒜素中、低剂量组有降低红细胞聚集性的作用，但不具有统计学意义。结果见表1。
       表1  大蒜素对红细胞聚集性的影响（略）
       与空白对照组比较，*P＜0.05；**P＜0.01；与急性高黏滞模型组比较，△P＜0.05；△△P＜0.01
       3.2   大蒜素对红细胞变形性的影响实验结果显示：急性高黏滞模型组红细胞滤过指数较对照组明显增大（P＜0.05），表明红细胞变形性。结果见表2。
       表2  大蒜素对红细胞变形性的影响（略）
       与空白对照组比较，*P＜0.05，与急性高黏滞模型组比较，△P＜0.05
       3.3   大蒜素对红细胞渗透脆性的影响急性高黏滞模型组开始溶血及完全溶血时的NaCl溶液浓度较对照组稍高，表明模型组大鼠红细胞对低渗盐溶液的抵抗力差，渗透脆性增大，渗透脆性在一定程度上反映了红细胞膜黏弹性，影响着红细胞的变形性。大蒜素各剂量组对红细胞渗透脆性的增大有改善作用，但均无统计学意义。结果见表3。
       3.4   大蒜素对红细胞膜流动性的影响急性高黏滞模型组红细胞膜荧光偏振度明显增高，表明膜流动性降低。大蒜素各剂量组对红细胞膜流动性的降低均有改善作用，但无统计学意义。结果见表4。
       表3  大蒜素对红细胞渗透脆性的影响（略）
       表4  大蒜素对红细胞膜流动性的影响（略）
       与空白对照组比较，*P<0.05
       4  讨论
          
       全血黏度是血液最基本的流动特性［7］。全血黏度增加，血流受阻，氧气和养分供应不足，能量代谢障碍，脏器功能受损。同时血流缓慢或停滞又可促使血栓形成。全血黏度在体内主要受到血浆黏度、红细胞压积、红细胞流变性等因素的影响［4］。血浆中因含有蛋白质、脂质、糖类等高分子化合物而具有一定黏度，血浆黏度增加可导致全血黏度增高；红细胞在血液的有形成分中数量最多，故红细胞压积也是影响全血黏度的主要因素之一，全血黏度随红细胞压积增高而变大。在本实验中，急性血淤症大鼠全血黏度、血浆粘度、红细胞压积均明显升高，反映模型大鼠血液流动性降低。大蒜素对以上指标均有明显改善作用，能降低血液黏度，加速血液流动性，改善微循环。
       
       红细胞的流变性主要体现在其变形性和聚集性两方面［7］。二者都影响血液黏度，变形性降低可以导致高切变率条件下全血黏度增高，聚集性增高可使低切变率条件下全血黏度增高，因此，改善红细胞变形能力和抑制红细胞聚集都能有效降低血液黏度，从而改善组织供血。红细胞的变形性主要取决于细胞的3个内在因素：红细胞膜的流动性和黏弹性、红细胞的几何形状、红细胞内液的黏度（即血红蛋白的理化性质及浓度）［4］。实验结果显示大蒜素对血淤症大鼠红细胞膜黏弹性的减弱及红细胞膜流动性的降低有改善的趋势，说明大蒜素对红细胞变形性的提高与影响红细胞膜的功能有关。红细胞的聚集性高低主要取决于血浆蛋白与球蛋白的桥联作用、流场中切变力的大小、红细胞表面电荷的多少3个因素［4］。红细胞的聚集程度可以用红细胞聚集指数来衡量，数值越大，表明红细胞聚集性越强。实验结果未表明大蒜素对红细胞聚集性的增强有明显降低作用，说明大蒜素降低低切血液黏度的作用主要与降低血浆黏度及红细胞压积有关。
       
       许多有血淤症临床症状的患者都伴有血液流变学指标的异常，且血液流变学指标的改变多早于临床表现，恢复正常又晚于临床症状和体征的消失，因此药物治疗血淤症的疗效确定应以血流变指标为标准。大蒜素可提高红细胞变形性和降低血液黏度，能改善血液流变性，可扩大其临床应用范围，如预防和治疗血淤症即高黏滞血症、改善微循环障碍、预防血栓形成等。
       【参考文献】
         　　［1］ 关 军,田家乐.大蒜素片作用机理及其药效学研究述要［J］.中医药学刊,2003,21(5):675，680
       
       ［2］ Balasenthil S, Rao KS, Nagini S. Altered cytokeratin expression during chemoprevention of experimental hamster buccal pouch carcinogenesis by garlic［J］.J Oral Pathol Med,2002,31(3)：142.
       
       ［3］ 陈 奇.中药药理实验方法学,第1版［M］.北京：人民卫生出版社,1996：564.
       
       ［4］ 秦任甲.临床血液流变学［M］.北京:北京大学医学出版社,2003：9.
       
       ［5］ 许文荣.临床血液学和血液检验实验指导［M］.北京:人民卫生出版社,2003：70.
       
       ［6］ 法祥光,甘午君,李会元，等.红细胞膜流动性的测定及其初步应用［J］.中华血液学杂志,1984,5(2)：132.
       
       ［7］ 廖福龙.临床血液流变学［M］.天津：天津科技翻译公司,1988：111.