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       【摘要】 
       目的观察大蒜素在体外对棘阿米巴的杀伤作用。方法将棘阿米巴用不同浓度的大蒜素30 ℃作用3,24 h后，在倒置显微镜下观察棘阿米巴的形态和其细胞增殖速率的变化。结果大蒜素浓度分别以0.01，0.1，1，10 g/L处理3 h时，棘阿米巴由滋养体转化为包囊，1，10 g/L处理3，24 h后观察到大量细胞分裂碎片；细胞生长曲线与对照组比较，0.1 g/L组增殖速率正常，而浓度高于1 g/L以上时培养4 d仍未见细胞增殖。 结论在体外大蒜素对棘阿米巴生长有明显抑制和杀伤作用。
       【关键词】  棘阿米巴； 大蒜素； 体外
       The Effect of Allitridium against Acanthamoeba in vitro
       ZHENG Shanzi, WANG Yuehua
       (College of Basic Medicine， Yanbian University Yanji 133000, China; Jilin Medical College，Jilin 132013,China)
       Abstract:ObjectiveTo detect the effect of allitridium on Acanthamoeba spp.MethodsAcanthamoeba spp. was cultured at 30℃ with different concentration of allitridium, the influence of allitridium on the morphological feature, proliferation speed was detected. ResultsAt concentrations of 0.01, 0.1, 1.0, 10 g/L Allitridium cultured for 3h, the Acanthamoeba trophozoites changed to cysts and in the 10 g/L allitridium group cell destroying could be detected. Cell proliferation could not detected.ConclusionAllitridium is effective to destroy Acanthamoeba in vitro.
       Key words:Acanthamoeba;  Allitridium;  in vitro
       
       棘阿米巴（Acanthamoeba）是一种广泛分布于自然环境中的自由生活的机会致病性原虫。致病性的棘阿米巴可引起人体肉芽肿性阿米巴性脑炎(Granulomatous Amoebic Encephalitis，GAE)和棘阿米巴性角膜炎(Acanhtamoeba Keratitis，AK)。自从Nagington等和Jones 等率先报道了由棘阿米巴引起的眼部感染病例以来，随着AK患者的不断增加，对棘阿米巴的研究引起了有关学者的广泛关注。目前报道至少已发现了26种棘阿米巴，其中常引起人体感染的主要是卡氏棘阿米巴（A.caslellanii）和多噬棘阿米巴(A.polyphaga)。
       
       大蒜为百合科葱属植物的鳞茎，长期以来被认为有抗细菌、抗真菌和抗寄生虫作用［1］ ，它的主要生物活性物质是含硫化合物。现代药物化学研究证明，大蒜内含硫成分多达三十余种，其中二烯丙基三硫化物普遍认为作用最强，通常将其称为大蒜素。有报道大蒜素对组织内阿米巴、锥虫、兰氏贾第虫、卡氏肺孢子虫、隐孢子虫和弓形虫发挥一定的抑制和杀伤作用 ［1～3］。本实验观察大蒜素在体外对棘阿米巴原虫的影响。
       1  材料与方法
       1.1  材料卡氏棘阿米巴由韩国庆北大学寄生虫学教研室郑东一教授提供。大蒜素为上海禾丰制药有限公司产品，批号为 5E38001。
       1.2  方法
       1.2.1  棘阿米巴的培养参照文献［4］方法培养。
       1.2.2  对棘阿米巴形态的影响对数期生长的棘阿米巴调整细胞悬液浓度2.5×105/ml，加入24孔细胞培养板中每孔1 ml。实验组分别每孔加入0.01，0.1，1，10 g/L大蒜素1 ml；对照组加等量的PYG培养液(proteose peptone-yeast eatract-glucose，PYG)，30℃培养3 h，在倒置显微镜下观察棘阿米巴的形态改变。
       1.2.3  对细胞增长速率的影响用定量培养法观察。将对数期生长的棘阿米巴调整细胞悬液浓度为 0.5×105/ml，加入24孔细胞培养板中，每孔1 ml。实验组分别加入0.01，0.1，1，10 g/L大蒜素1ml；对照组加等量的PYG，每组设4个平行孔。30℃培养24 h 时,制作棘阿米巴生长曲线，并接种于固体培养基，观察其生长情况。
       2  结果
       2.1  对棘阿米巴形态的影响棘阿米巴滋养体多为不规则长圆形，直径多为15～45 μm，体表有多个细小的棘刺状突起，胞质内可见多个空泡；包囊类圆形，直径9～27 μm，有两层囊壁，内壁呈多面体型。当大蒜素浓度等于或高于0.1 g/L培养3 h时，棘状伪足消失，形成包囊；10 g/L组细胞数量很少观察到完整包囊，可见细胞碎片；而0.01 g/L组与对照组相比较，未见明显形态变化。
       2.2  对棘阿米巴增殖速率的影响用不同浓度的大蒜素作用24 h后进行培养，制作生长曲线。结果见图1。接种后6 h对照组和0.01 g/L组可见棘阿米巴生长，而其他实验组均未见棘阿米巴生长；对照组棘阿米巴数量在24 h内约增加了5倍，而0.01 g/L组在24 h内出现细胞生长抑制，24 h后数量明显增加，与对照组生长趋势几乎相似；0.01 g/L组接种后24 h，可见棘阿米巴增殖；1 g/L和10 g/L组接种后4 d仍未见棘阿米巴生长。将在30℃培养24 h的对照组、0.1 g/ml、1 g/ml组，各50 ml细胞悬液离心固定后，又加以空白管对比观察，发现沉淀细胞数量有显著差异。
       3  讨论
       
       棘阿米巴可引起眼部和中枢神经系统的亚急性或慢性感染。棘阿米巴引起的GAE常发生于体质虚弱的老年人或因肿瘤、慢性消耗性疾病或AIDS等原因免疫功能低下的人群中机会致病，而AK常发生于健康人，是一种严重威胁视力的致盲性角膜病。
       图1  大蒜素对棘阿米巴生长曲线的影响（略）
       
       棘阿米巴原虫形态包括活动期的滋养体和静止期的包囊两个阶段, 当药物作用于棘阿米巴滋养体时会迅速转化为包囊。文献报道多数药物仅对棘阿米巴滋养体有杀伤作用，而对包囊的作用较弱。在体外实验中已证明PHMB、洗必泰、两性霉素、巴龙霉素、罗他霉素、羟乙磺酸丙氧苯脒、咪康唑以及地咪类等［5～6］药物药物对棘阿米巴有效，但其效果不理想。目前认为PHMB和洗必泰的作用最强，其对多数棘阿米巴滋养体有效作用浓度为0.5～1.0 mg/L，对包囊有效作用浓度1～5 mg/L［6］ 。
       
       大蒜为百合科葱属植物的鳞茎，主要生物活性物质是成分是含硫化合物学，二烯丙基一硫化物、二烯丙基二硫化物、二烯丙基三硫化物等，其中大蒜素-二烯丙基三硫化物作用最强。大蒜素抑制某些酶的作用对病原微生物产生影响，也能通过抑制细胞增殖和诱导细胞凋亡，在体外对多种寄生虫有良好抑制作用。Lun等［1］ 报道大蒜素对溶组织阿米巴和贾第虫的抑制率为50%时的浓度分别为59 mg/ml和14 mg/ml。 本实验研究显示，0.1 g/L大蒜素处理24 h, 使棘阿米巴滋养体转化为包囊，并抑制其增殖；1 g/L 作用3 h可使棘阿米巴滋养体转化为包囊，培养4 d仍无复苏，10 g/L 作用3 h即可观察到滋养体裂解，表明浓度高于0.1 g/L时对包囊亦有明显的抑制作用, 1 g/L 作用3 h时有明显杀伤作用。本实验从不同浓度和时间观察大蒜素对棘阿米巴作用后的细胞形态、增殖速率变化，证明了不同浓度的大蒜素对棘阿米巴原虫的生长有明显的抑制和杀伤作用，并且其作用与剂量和作用时间相关。大蒜素有效作用浓度较低，且具有来源广泛、价格低廉、副作用少等特点，是很有前景的治疗药物。
       【参考文献】
         　　［1］ Lun ZR, Burri C, Menzinger M, et al. Antiparasitic activity of diallyl trisulfide (Dasuansu) on human and animal pathogenic protozoa (Trypanosoma sp., Entamoeba histolytica and Giardia lamblia) in vitro［J］.Ann Soc Belg Med Trop, 1994,74(1):51.
       
       ［2］ Rivasi F, Longanesi L, Casolari C, et al. Cytologic diagnosis of Acanthamoeba keratitis. Report of a case with correlative study with indirect immunofluorescence and scanning electron microscopy Acta［J］.Cytol, 1995, 39(4):821.
       
       ［3］ Turner ML，Cockerell EJ. Antigens of selected Acanthamoeba species detected with monoclonal antibodies［J］.Int J Parasitol, 2005, 35(9):981.
       
       ［4］ 郑善子，申成华，玄英花,等. 棘阿米巴的分离及实验室培养［J］.延边大学医学学报，2003,26（3）: 168.
       
       ［5］ Wilhclmus KR. Antiparasitic drugs in Ophthalmology［J］.Int Ophthalmol Clin , 1996, 36(2):117.
       
       ［6］ Kbunkitti W, Lloyd D, Fure JR, et al.The lethal effects of biguanides on cysts and trophozoites of Acanthamoeba castellanii［J］.J Appl Bacteriol .1996, 81(1):73.