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       【摘要】 
       目的探讨地黄饮子对AD模型大鼠的学习记忆及炎性反应的影响。方法模型组以D半乳糖腹腔注射合并Aβ注射海马制备AD动物模型，各治疗组分别在造模的同时灌胃地黄饮子和抗脑衰胶囊、哈伯因。运用MORRIS水迷宫检测各组大鼠的学习记忆能力及采用免疫组化方法观察各组大鼠海马神经元TNFα，IL1α蛋白的变化。结果治疗组能缩短潜伏期、增加过台次数，第四象限与其它象限游泳距离之间比较也有差异，说明地黄饮子能改善痴呆大鼠空间探索记忆能力，低剂量组已经显效，高剂量组效果更为明显。地黄饮子治疗组IL1α，TNFα含量显著下降，且具有剂量差别。结论 地黄饮子对痴呆模型大鼠学习记忆空间探索能力有改善作用及能有效抑制海马神经元炎性反应，其作用机理可能与地黄饮子抑制海马神经元TNFα，IL1α蛋白，抑制小胶质细胞活性进而减轻海马神经元的炎症损伤有关。
       【关键词】  地黄饮子； 老年性痴呆； β淀粉样蛋白； MORRIS水迷宫； 炎性反应
       Effect of Decoction of Rehmanniae on Improving Learning Memory Ability  and Inflammation Reaction of  Alzheimer"s  Disease  Model  Rats
       SONG Lin，AN Ping，PIAO Zhongyuan， XIE Ning，YAO Lifen
       (Heilongjiang University of Traditional Chinese Medicine,  Harbin 150040，China; The First Hospital of Jilin University, Changchun，130012  China; The First Hospital of Harbin Medical University,150086，China )
       Abstract：ObjectiveTo investigate effects of Decoction of Rehmanniae（DR） on improving learning  memory ability and inflammation reaction of Alzheimer"s disease(AD) model rats.MethodsAD model rats induced by D-galactose intraperitoneal injection and the hippocampus injected β-amyloid(Aβ) were made. Every group was fed with Hup A, Kangnaoshuai and DR. The ability of learning memory was measured by Morris water maze(MWM). The inflammatory reaction of hippocampus neurons were observed by electron lens using immunohistochemistry method.Results DR could shorten the escape latency and increase the number of passing plats and the swimming distance of the fourth quad compared with the other quads.  DR could dose-dependly reduce the expression of TNFα，IL1α protein of Hippocampus neurons. ConclusionDR can improve the ability of spatial exploratory and effectively control the inflammation reaction. The mechanism of action is possibly relevant that DR can decrease the expression of IL1α and TNFα to inhibit the activity of glia cell and inflammatory injury of hippocamus neurons.
       Key words：Decoction of Rehmanniae；  Senile Dementia；  βamyloid ；  Morris water maze；  Inflammation reaction
       
       老年性痴呆（Senile dementia）,亦称阿尔茨海默病（Alzheimer"s disease，AD），是一种常见于老年人的神经退行性疾病。本实验根据AD发病的β淀粉样蛋白（Aβ）致病学说［1］制备AD复合动物模型，观察地黄饮子对拟AD模型大鼠的学习记忆及炎性反应的影响，旨在探讨本方防治AD的作用机理。
       1  器材
       1.1   动物  健康Wistar雄性大鼠140只，普通级，重（260±20）g，黑龙江中医药大学实验动物中心（许可证编号:黑动字第P0010200A号）提供。
       1.2  药物与试剂  地黄饮子制备方法：醇、水提取液与挥发油提取液，离心、浓缩至适量。合并上述醇、水提液及挥发油制成含生药1 g/ml的浓缩液。抗脑衰胶囊由石家庄四药股份有限公司生产(国药准字Z13021850，生产批号040107) ，配制成含生药0.2403 g/ml水溶液。哈伯因由河南竹林众生制药股份有限公司生产(国药准字H10940156，生产批号040103) ，配制成0.001 8/L水溶液。试剂：D半乳糖由上海华舜生物工程有限公司提供（批号707222）。Aβ140，Sigma公司提供（Lot:088K49512）。TNFα，IL1α免疫组化试剂盒，均由武汉博士德生物工程有限公司提供。pv6001/2二步法免疫组化试剂盒由北京中山生物技术有限公司提供。
       1.3  仪器脑立体定位仪（NARISHIGE SN-2型 日本）、MORRIS水迷宫系统（DMS2中国医学科学院药物研究所）、摄影显微镜（OLYMPUS日本）等。
       2   方法
       2.1  分组方法140只Wistar大鼠随机分成7组：空白组、假损伤组、模型组、抗脑衰对照组、哈伯因对照组、中药治疗高、低剂量组，每组20只。
       2.2  模型制备［2］假损伤组腹腔注射生理盐水，余组均给予D半乳糖（50 mg/kg·d）腹腔注射4周，造成亚急性衰老；4周后在脑内注射凝聚态Aβ140（Aβ用无菌生理盐水稀释成10 μg/μl，37℃孵育1周）。假损伤组注射生理盐水1 μl，其余各组均注射Aβ。
       2.3  给药方法  中药治疗组腹腔注射造模同时分别给予地黄饮子高、低剂量灌胃［相当于生药5.4 g/（kg·d）和2.7 g/（kg·d）］，中、西对照组分别给予抗脑衰胶囊、哈伯因溶液灌胃［含生药分别为2.403，0.018 mg/（kg·d）］，余组灌胃等量蒸馏水，1次/d，共5周。
       2.4   观察指标
       2.4.1  学习记忆指标测试-空间探索试验操作方法［3］ 将平台放在第四象限中间，在其他3个象限任选一点面向水池池壁，将大鼠放入水中，实验历时5 d，每天上午每个象限各测试1次，每次测试1 min，先训练4 d，在第5天，将平台移走，记录每只大鼠第1次经过原平台的时间（潜伏期），每只大鼠在1 min内经过平台的次数、游过的总距离以及在原平台所在象限及其它3个象限内逗留的时间、距离；并分别计算出在第4象限游泳的时间（t4）和距离（L4）占整个游泳时间（t总）和距离（L总）的百分比。
       2.4.2  脑IL1α，TNFα蛋白表达检测    行为学测试完毕，大鼠迅速处死取脑，固定，选取注射部位，修块，再固定，乙醇梯度脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，切片，采用免疫组化（PV二步法）检测IL1α，TNFα蛋白表达，光镜下观察鼠脑海马细胞蛋白表达。其中滴加一抗（均1∶50比例稀释），滴加二抗（均是山羊抗兔）工作液，阴性对照为一抗加PBS。
       2.5  数据处理数据采用±s表示，数据统计分析均在SPSS11.0软件中进行，采用方差分析，多组间两两比较用LSD法。
       3  实验结果
       3.1  地黄饮子对AD大鼠Morris水迷宫行为学--空间探索实验的影响结果见表1～2。
       表1  大鼠空间探索实验结果（略）  
       与空白组、假损伤组比较，△△P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01
       表2  大鼠空间探索试验结果（略）  
       与空白组、假损伤组比较，△△P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与西药对照组比较，#P＜0.05；组内第四象限与其它象限比较，0P＜0.05，00P＜0.01
       
       结果表明，与空白组比较，模型组潜伏期延长、过台次数减少，差异显著（P＜0.01），表明模型鼠空间探索能力下降。给药组中，治疗组和对照组均能缩短潜伏期、增加过台次数，与模型组相比具有明显差异（P＜0.05或P＜0.01），说明治疗有效。各治疗组和对照组第四象限与其它象限游泳距离之间比较也有差异（P＜0.05），而模型组大鼠象限游泳距离差异无显著性（P＞0.05）。表明正常组和各治疗组大鼠对原平台象限的记忆较模型组好。同时我们计算出各组大鼠在原平台象限第四象限游泳的时间(t4)和距离(l4)与总游泳时间(总)即60 s和总距离(L总)之比(t4/t总，l4/L总)。经分析各治疗、对照组与空白组t4/t总、l4/L总比较均有差异（P＜0.05或P＜0.01），中药高剂量组大鼠与西药对照组l4/L总比较有差异（P＜0.05），说明地黄饮子对痴呆大鼠有改善记忆作用，低剂量组已经显效，高剂量组效果更为明显，且优于西药对照组。
       3.2  地黄饮子对AD大鼠脑IL1α，TNFα蛋白的影响蛋白表达的判断标准：海马CA1区IL1α蛋白阳性表达，胞核和胞浆均呈棕黄色细微颗粒状。在海马CA1区可见明显的TNFα阳性表达，胞体较小，呈卵圆形、梭形或三角形，胞浆浓染，突起较少，大多为小胶质细胞。实验结果采用CMIAS多功能真彩色病理图象分析系统进行分析，将图像输入计算机，计算阳性目标总面积与统计场总面积比值，取平均值进行统计分析。结果如表3及图1～6 (200×) 所示。
       表3  各组大鼠海马神经元IL1α，TNFα蛋白表达的影响（略）  
       与空白组、假损伤组比较△△P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05,**P＜0.01;n=8
       
       结果显示，模型组IL1α，TNFα均呈强阳性表达，与空白组和假损伤组相比差异显著（P＜0.01）。表明AD动物模型诱导脑组织IL1α，TNFα蛋白表达增强。经治疗后各组IL1α，TNFα蛋白含量均显著下降，其西药对照组及高剂量组效果最为显著（P＜0.01），低剂量、中药对照组也显示出良好的疗效（P＜0.05），说明地黄饮子高剂量与哈伯因均能有效抑制海马神经元升高的相关炎性蛋白表达，尤以地黄饮子效果最佳，且具有剂量差别。
       图1  免疫组化ILIα海马空白组200×  （略）           
       图2  免疫组化ILIα海马模型组200×（略）
        
       图3  免疫组化ILIα海马中药高剂量组200×（略）           
       图4  免疫组化TNFα海马模型组200×（略）
       
       图5  免疫组化TNFα 海马中药高剂量组200× （略）          
       
       图6  免疫组化TNFα海马西药对照组200×（略）
                       
       4  讨论
       
       现已发现AD发病早期，炎症反应有利于Aβ的清除，对神经有保护作用。但过度激活的小胶质细胞（特别是位于老年斑附近）能分泌细胞因子，主要有IL1α，IL1β，IL6，S100β、TNFα，γIFN和一些早期补体成分等。可见神经胶质细胞及其产生的多种炎性产物介导了这一个病理损伤过程。在Aβ刺激下，小胶质细胞产生IL1是始动环节，IL－1除上调小胶质细胞或星形胶质细胞表达其它细胞因子外，尚诱导补体、急性期蛋白、氧自由基、NO，βAPP等生成增加。这些分子各自通过作用于胶质细胞或神经元，促进其它炎性分子的产生，这种交互作用促进了慢性炎症反应的形成和炎性产物水平持续升高，对神经生长与神经可塑性、损伤与变性及各种死亡机制产生广泛的影响［4］。TNF-α在炎症反应中是激活细胞因子级联反应的主要物质，它还可直接作用与星形胶质细胞和少突胶质细胞，导致髓鞘和少突胶质细胞的损伤，引起少突胶质细胞凋亡来发挥比TNF-α更大细胞毒性作用［5］。
       
       本实验中，地黄饮子治疗组能缩短潜伏期、增加过台次数，第四象限与其它象限游泳距离之间比较也有差异，说明地黄饮子对痴呆大鼠有改善空间探索记忆作用，低剂量组已经显效，高剂量组效果更为明显。地黄饮子高剂量组IL1α，TNFα含量显著下降，说明地黄饮子能有效抑制海马神经元升高的相关的炎症蛋白表达，且具有剂量差别。我们在实验中认识到［6，7］：Aβ能诱导脑组织产生大量自由基，MDA含量明显升高，降低 SOD，CAT和GSHPx活性，使Ca2+大量内流。地黄饮子可以通过调节抗氧化酶活性起间接抗氧化作用，提高CAT和GSHPx协同作用以使细胞内H2O2 浓度保持在稳定水平,缓解其毒性。因此我们推测，地黄饮子有效成分有可能通过消除自由基的产生，提高抗氧化酶活性，调节细胞膜通透性，保持钙稳态的作用，来下调海马神经元TNFα，IL1α蛋白表达，抑制小胶质细胞活性，减轻海马神经元的炎症损伤，从而改善痴呆大鼠空间探索记忆能力。
       【参考文献】
         　　［1］ Selkod DJ.Alzheimer"s disease: a central role for amyloid［J］.Neuropathol Exp Neurol,1994,53：438.
       
       ［2］ 谢 宁，宋 琳，牛英才，等.地黄饮子对老年性痴呆模型鼠脑神经元细胞凋亡及超微结构的影响［J］.中国临床康复，2005，10(7)：93.
       
       ［3］ 张魁华,赖世隆，王 奇，等.补肾益智方对老年性痴呆模型动物空间探索学习记忆功能的改善作用［J］.中草药，2002，33（12）：1093.
       
       ［4］ 韦道祥,陈俊抛.小胶质细胞与阿尔茨海默病［J］.国外医学·老年医学分册,2000，11：248.
       
       ［5］ Velzaquez P,et al.Asparate residue in amyloid beta-protein is critical for classical complement pathway activity implication for Alzheimer’s disease pathogenesis［J］.Natl Med,1997,3(1)：77.
       
       ［6］ 谢 宁，邹纯朴，周妍妍，等.地黄饮子脑脊液对离体神经元AD模型自由基损伤的保护作用及相关酶的影响［J］.中医药信息，2003，20（6）：59.
       
       ［7］ 谢 宁，周妍妍，何秀丽，等.地黄饮子对老年性痴呆大鼠行为学及酶学的影响［J］.中西医结合心血管病杂志，2003，11（1）：650.