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       【摘要】 
       目的探讨万年蒿超临界萃取物和水提液对小鼠肝脏损伤的保护作用。方法分别以万年蒿超临界萃取物和水提液灌胃小鼠,并以CCl4制成小鼠急性肝脏损伤模型，测定小鼠血清中门冬氨酸氨基转移酶(AST）和丙氨酸氨基转移酶(ALT）含量，观察万年蒿不同提取物对肝脏损伤的保护作用。结果和模型组相比，万年蒿水提液高剂量组和超临界萃取物高剂量组能够明显降低小鼠的AST，ALT含量(P<0.05或P<0.001)。结论万年蒿提取物具有较好的保肝作用。
       【关键词】  万年蒿； 四氯化碳； 肝损伤； 超临界萃取
       Protective Effects of Extracts of Artemisia sacrorum Ledeb. on Acute Hepatic Injury in Mice
       PIAO Guangchun,QUAN  Yingchun
       (College of Pharmacy, Yanbian University, Yanji, Jilin 133000，China）
       Abstract：ObjectiveTo study the protective effects of supercritical fluid extraction (SFE) extracts and water extracts of Artemisia sacrorum Ledeb. on acute hepatic injury in mice.MethodsThe mice were perfused with water extracts and SFE extracts respectively. The mouse model of acute hepatic injury were induced by CCl4 and the serum levels of ALT and AST of the mice were measured. ResultsThe high-dose groups of water extracts and of SFE extracts greatly decreased AST and ALT levels in serum compared to model group(P<0.05 orP<0.001).ConclusionThe extracts of Artemisia sacrorum Ledeb. have protective effects against hepatic injury. 
       Key words：Artemisia sacrorum Ledeb;  CCl4;  Hepatic injury;  Supercritical fluid extraction (SFE)
       
       万年蒿为菊科植物万年蒿Artemisia sacrorum Ledeb. 干燥地上部分，也可为全草。有利湿退黄、凉血止血作用［1～3］。民间常用其治疗急慢性肝炎、妇女内寒证等。东北某些地区在治疗黄疸等肝炎症状时，更愿意选用万年蒿替代茵陈蒿作为首选药物。
       
       本文通过测定小鼠血浆中门冬氨酸氨基转移酶(AST）和丙氨酸氨基转移酶(ALT）等的含量，研究了万年蒿的超临界萃取等四种提取物对CCl4所致小鼠肝损伤的影响，为进一步研究万年蒿的保肝作用打下了基础。
       1  器材
       1.1  药材与试剂 万年蒿采集自吉林省延吉市溪洞，由延边大学药学院生药学教研室刘永镇教授鉴定为Artemisia sacrorum Ledeb.的地上部分；四氯化碳（天津开发区海晶精细化工厂）；试剂盒（ALT，AST）（北京北化康泰临床试剂有限公司）；羧甲基纤维素钠；吐温-80等。
       1.2  仪器沈阳天诚超临界流体萃取仪（TC-SFE-50-5-5-120S）；紫外分光光度计（上海棱光技术有限公司，S22PC）； R2060旋转蒸发仪（上海申生科技有限公司，R2060）；离心机（德国制造，型号：IGMA95308）；200μl移液器（pipetman,France）, 1000μl移液器（XL3000i, Denville）。
       1.3  动物昆明种小鼠, 60只雄性，22～25 g，由延边大学医学院动物科提供。
       2  方法
       2.1  提取方法
       2.1.1  万年蒿水提法取500 g万年蒿加入适量水中浸泡，1 h后，加热至沸，提取两次，1 h/次，合并滤液，用旋转蒸发仪浓缩。参考万年蒿的成人剂量，通过体表面积转换，配制成灌胃小鼠的低、高两个浓度，分别为：6.5 g(相当于生药量)/kg，26.0 g(相当于生药量)/kg。
       2.1.2  超临界萃取法投药800 g万年蒿于超临界萃取仪里，分别进行了两次萃取。第一次没有提携剂，第二次以无水乙醇为提携剂。具体实验条件及结果如下。
       表1  万年蒿超临界萃取条件（略）  
       2.2  超临界萃取物的配制取适量无水乙醇作为提携剂的超临界萃取物，用少量吐温-80和配制好的0.05 g/ml羧甲基纤维素钠溶液作为溶剂配制成低、高两种浓度：0.45，0.90 g/kg（这两个浓度均以超临界萃取物的质量绝对值进行计算）。      
       2.3  动物实验
       2.3.1  实验方法从动物科取回小鼠后，放置于药学院动物室，使其适应环境数日。小鼠随机分成6组，每组10只：第1组：正常组;第2组：急性肝损伤模型组;第3组：万年蒿的水提液低剂量组（6.5 g/kg）;第4组：万年蒿的水提液高剂量组（26.0 g/kg）; 第5组：万年蒿超临界萃取物低剂量组(0.45 g/kg); 第6组：万年蒿超临界萃取物高剂量组(0.90 g/kg)。正常组和模型组灌胃蒸馏水，其余各组分别灌胃上述剂量的相应药物，连续4 d。第5天上午灌胃一次，过2 h正常组腹腔注射相应的生理盐水，其它各组小鼠腹腔注射0.1% CCl4豆油溶液0.1 ml/10 g。 24 h后由小鼠颈动脉取血（取血前12 h前开始禁食）, 离心机3000 r/min分离血清, 根据试剂盒方法测定AST，ALT［4，5］。
       2.3.2  统计处理动物实验数据以+s 表示，组间差异用t检验进行显著性分析。
       3  结果
          
       动物实验结果如表2。
       表2  万年蒿对四氯化碳所致肝损伤小鼠的影响（略）  
       与正常组比较,#P<0.05；与模型组比较,*P<0.05；P<0.001，n=10
       
       由表一可知，模型组的ALT，AST数据与正常组相比，P<0.05, 说明用四氯化碳所致小鼠肝损伤造模是成功的。4个万年蒿组的ALT，AST值均低于相应的模型组。其中超临界萃取物高剂量组、水提液高剂量组的AST值与模型组相比，有统计学上的显著性意义（P<0.05或P<0.05）; 水提液高剂量组的ALT值与模型组相比，有显著性差异（P<0.001）。
       4  讨论 
          
       万年蒿（Artemisia sacrorum Ledeb.）具有清热解毒，利湿，退黄，凉血止血等作用，近年研究发现其有明显的的利胆作用［6］ 。目前，在吉林省延边地区仍有万年蒿膏剂民间出售，用于治疗和预防急慢性肝炎，妇女内寒证等，在民间有广泛的应用基础。但是有关万年蒿的研究报道并不多，并且多局限于成分分析。为提高疗效对其所做的药理实验更是少见。因此有必要通过实验验证其抗肝损伤活性，并以现代技术加以开发，分离精制其有效部位，从而大大提高疗效。
       
       在应用上，万年蒿多为水煎煮液，因此相比脂溶性成分，水溶性成分更能体现中药应用中的宝贵经验。因此，本实验以两种浓度的水提液进行了相关的抗肝损伤药理实验。      
       
       但是，水煎液在体现宝贵经验的同时，有一个弱点，即破坏热敏性物质及脂溶性成分提取不完全。因此，本实验采用了超临界流体萃取，以试图很好地解决这个问题。
       
       处于高于其临界温度和临界压力的情况下的超临界流体，性质介于气体和液体之间，其密度接近液体，而扩散系数则接近气体，因而不仅具有与液体溶剂相当的萃取能力，而且具有优良的传质效果。超临界流体萃取是以超临界流体为萃取剂，从中药材中萃取药效成分并进行分离的方法。CO2临界条件适中（Pc=7.39 MPa,Tc=31.06℃），而且本身无毒无腐蚀性，故成为超临界流体萃取法最常用的超临界流体，通常称为CO2超临界流体萃取法。
       
       超临界流体萃取与传统方法相比，具有萃取时间短、得率高、有效成分含量高、质量稳定、简便和安全等优点。更重要的是由于萃取温度较低，中药中易挥发组分或生理活性物质极少受到损失或破坏，超临界流体萃取非常适合于分离热敏性和化学性质不稳定性的物质，因而在医药、食品、化工等领域受到广泛重视。提携剂能够增加溶质溶解度对温度、压力的敏感程度，可使溶质的选择性大大提高。因此添加适当极性提携剂的CO2超临界流体萃取法能够创造一般溶剂达不到的萃取条件，可以对极性物质进行萃取，大幅度提高萃取收率［7～11］。本实验以无水乙醇做提携剂进行了CO2超临界流体萃取并用萃取物进行了抗肝损伤药理实验。
       
       实验结果初步证明民间使用水煎液的做法非常合理，水提液低、高剂量组的ALT，AST值均低于肝损伤模型组。另外，水提液高剂量组的AST值与模型组相比，有统计学上的显著性意义（P<0.05）; 水提液高剂量组的ALT值与模型组相比，有显著性差异（P<0.001）。日后水煎液如以大孔吸附树脂等技术加以分离，必能富集抗肝损伤有效成分群，从而大大提高抗肝损伤活性。
       
       超临界萃取物高剂量组的AST活性与肝损伤模型组相比，有统计学上的显著性意义（P<0.05）。说明如果选择好剂量，有可能会收到更好的效果。从而能够补充水提液损失掉的对抗损伤有益的成分群，更好地发掘万年蒿的潜力。
       
       万年蒿作为有悠久、广泛应用基础的民间药物，发展潜力巨大，发展前景看好。本实验初次使用超临界流体萃取法对万年蒿进行了萃取并做了相关的抗肝损伤药理研究，力图以现代技术分离其有效部位，提高疗效，为开发保肝保健品及抗肝炎新药提供技术支持和理论基础。
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