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       【摘要】 
       目的用反相高效液相色谱（RP-HPLC）法测定胡芦巴中原薯蓣皂苷的含量。方法采用HPLC法，色谱柱为Lichrospher C18(4.6 mm×250 mm, 5μm)，流动相为乙腈水(8∶92, V/V)，检测波长为203 nm。结果含量测定的线性范围为0.108～1.296 μg，回收率为96.37%，RSD为1.78% (n=6)。结论该法简便，灵敏准确，可用于胡芦巴中原薯蓣皂苷的质量控制。
       【关键词】  反相高效液相色谱； 胡芦巴； 原薯蓣皂苷
       Determination of Protodioscin in Trigonella foenum-graecum L. with RP-HPLC
       YU Shuxian，GUO Qingfeng，ZHANG Wei，ZHENG Xiangjuan，HAO Xiaoxia，LUO Dongmei
       (Department of Chemistry of  Nanchang University,  Nanchang 330047， China)
       Abstract：Objective To establish an RP-HPLC method for the determination of the protodioscin in Trigonella foenum-graecumL..MethodsThe analytical column was a Lichrospher C18 (4.6 mm×250 mm,5 μm). The mobile phase consisted of acetonitrile-water(8∶92, v/v)．The protodioscin was detected at 203 nm．ResultsThe calibration curve was linear over the range of 0.108～1.296μg (r=0.999 9).The average recovery of the method was 96.37%，RSD was 1.78% (n=6) . ConclusionThis method is reliable and accurate, and can be used for quality control of protodioscin in Trigonella foenum-graecum L.
       Key words：RP-HPLC；  Trigonellafoenum-graecumL.；  Protodioscin
       
       胡芦巴为豆科植物胡芦巴属胡芦巴Trigonellafoenum-graecumL.的种子，在我国主产于贵州、江西、河北、安徽、四川、新疆等地，且南北各地均有栽培。干燥的胡芦巴种子有温肾、祛寒、止痛的功效，主治肾藏虚冷、小腹冷痛、小肠疝气、寒湿脚气等症［1］。胡芦巴的主要化学成分为甾体皂苷、黄酮及其苷、三萜、生物碱、香豆素、有机酸及油脂等，其中甾体皂苷是其主要成分［2］。原薯蓣皂苷（protodioscin ）属于甾体皂苷，Hiroshige等［3］在胡芦巴中发现含有原薯蓣皂苷，该有效成分具有增强性功能﹑降血脂、对癌细胞有毒杀和抗白血病等作用［4～7］。刘中博等［8］建立了HPLC法测定薯蓣属中原薯蓣皂苷的含量，但未见测定胡芦巴中原薯蓣皂苷含量的报道。
       
       本文首次建立了胡芦巴中测定原薯蓣皂苷含量的HPLC法，该方法以乙腈水(8∶92，V/V)流动相体系下在10 min内完成了对胡芦巴中原薯蓣皂苷的分离和检测，同时样品预处理步骤少，操作简便实用，灵敏度高、选择性好。为胡芦巴和含胡芦巴类中成药的质量评价和控制提供了快速分离分析方法。
       1  仪器与试药
       1.1  仪器美国Waters公司2695型高效液相色谱仪；Waters2996 型二极管阵列检测器；Gold Spectrumlab 54 紫外可见分光光度计(上海棱光技术有限公司)；KQ2200E型超声仪(昆山市超声仪器有限公司)；RE-52AA型旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂)；Sartorius十万分之一电子天平(德国)。
       1.2  试药药材胡芦巴购自江西省药材公司 (产地贵州省)，经江西医学院冯江教授鉴定为正品胡芦巴，原薯蓣皂苷对照品由中国药品生物制品检验所提供，乙腈为色谱纯，高纯水，其他试剂均为分析纯。
       2  方法与结果
       2.1  色谱条件Lichrospher C18柱(4.6 mm×250 mm, 5 μm)；流动相：乙腈水(8∶92，V/V)；柱温：30℃；流速：0.5 ml/min；检测波长:203 nm。在此色谱条件下,供试品色谱图中原薯蓣皂苷达到基线分离，其色谱峰保留时间与相应对照品一致，出峰时间恰当，见图1。
       图1  原薯蓣皂苷样品(a)和对照品(b)的HPLC图谱（略）
       2.2  检测波长的确定用紫外可见分光光度计在200～450 nm范围内扫描对照品溶液，由图2可见在203 nm处有最大吸收，故以203 nm作为测定原薯蓣皂苷含量的检测波长。
       2.3  对照品溶液的制备精密称取于50℃干燥2 h的原薯蓣皂苷对照品2.70 mg，置于25 ml容量瓶中，用流动相超声溶解，并定容至刻度，摇匀，即得对照品溶液（0.108 mg·ml-1）。
       2.4  供试品溶液的制备准确称取过筛40目干燥至恒重的胡芦巴粉末0.50 g，用正己烷进行索氏脱脂2h，脱脂后用75%的乙醇溶液30 ml超声提取15 min，过滤。重复两次超声提取和过滤，滤液合并，滤液经减压蒸馏至干，浓缩液用流动相超声溶解，并定容于25 ml容量瓶中，作为供试品溶液，经0.45 μm滤膜滤过，进样10 μl，按外标法定量分析，样品的色谱分离结果见图1(a)。
       2.5  标准曲线和线性范围考察依次精密吸取对照品溶液1，2，4，6，10，12 μl进样，记录峰面积，以峰面积值（Y）对原薯蓣皂苷的进样量（X）进行线性回归，得回归方程为Y=11 582.93X-16.73，r=0.999 9，检出限10 ng（对进样10 μl而言，S/N=3）。结果表明原薯蓣皂苷在0.108～1.296 μg范围内线性关系良好。
       图2  原薯蓣皂苷的紫外扫描图（略）
       2.6  仪器精密度实验取对照品溶液10 μl，按前述色谱条件，连续重复进样6次，测定峰面积值，RSD为0.56%，说明仪器的精密度良好。
       2.7  稳定性实验取同一供试品溶液，分别在0，4，8，12，16，24 h依次测定，结果峰面积RSD为0.78%，表明供试品溶液在24 h内稳定。
       2.8  样品含量的测定和方法精密度测定按照前述2.4供试品溶液制备方法，精密称取胡芦巴粉末0.50 g，分别制备5份供试品溶液，每次进样10 μl，按外标法计算原薯蓣皂苷的含量，结果见表1。按上述色谱条件测定原薯蓣皂苷的质量分数，结果平均为0.156%，RSD为1.32%，重现性良好。
       表1  胡芦巴中原薯蓣皂苷的含量（略）
       2.9  加样回收率实验称取0.50 g已知原薯蓣皂苷含量的胡芦巴粉末6份，分为两组，分别在每组样品中加入1.0，1.5和2.0倍左右的原薯蓣皂苷背景含量（0.156%）的对照品，按2.4项下方法操作，在上述色谱条件下测定，计算加样回收率，结果平均回收率为96.37%，RSD为1.78% (n=6)。
       3  讨论
       
       在供试品溶液制备过程中，分别采用了超声提取法、索氏提取法、回流提取法进行比较。索氏提取法和回流提取法，不仅提取时间较长，提取液含杂质较多，而且药液长时间处于被加热状态，有效成分容易受到破坏，测出的原薯蓣皂苷的质量分数偏低。超声提取技术已被用于多种植物的提取，具有提取时间短、提取率高、节省溶剂和时间、提取液含杂质较少、能避免高温对有效成分的破坏等优点，故选择超声提取法。
       表2  加标加样回收率实验结果（略）
       在超声提取中考察了乙醇含量（0%，25%，50%和75%）对提取的影响，结果表明75%乙醇作为溶剂的提取效率最高，故选用75%乙醇作为提取溶剂。
       
       测定甾体皂苷含量的样品预处理方法通常有：正丁醇萃取预处理或大孔吸附树脂预处理。预处理步骤多必然会对结果有影响。在作者已建立的HPLC方法中，不经过正丁醇萃取或大孔吸附树脂预处理，即可达到基线分离，从而使结果更为准确。
       
       首次采用RP-HPLC方法测定胡芦巴中原薯蓣皂苷，质量分数为0.156%。该方法简便、快速，可以用于胡芦巴和含胡芦巴类中成药的质量评价和控制。
       【参考文献】
         　　［1］ 国家药典委员会.中国药典［S］.北京：化学工业出版社，2005：167.
       
       ［2］ 荆 宇,赵余庆.胡芦巴化学成分和药理作用研究进展［J］.中草药，12：1146.
       
       ［3］ Hiroshige Hibasam.Protodioscin isolated from fenugreek (Trigonella foenumgraecum L.induces cell death and morphological change indicative ofapoptosis in leukemic cell line H-60, but notin gastric cancer cell line KATO III［J］.International Journal of Molecular Medicine,2003.11: 23.
       
       ［4］ 陈惠芳.植物活性成分辞典，第1册［M］.北京：中国医药科技出版社，789.
       
       ［5］ 陈 俊, 刘继红. 促进阴茎海绵体平滑肌松弛的植物性中药研究进展［J］.中华男科学，2003，9：615.
       
       ［6］ 刘锡葵，陈国珍，杨庆雄，等.甾体皂苷的心血管活性研究［A］.见：中国药学会学术年会论文集(下册)［C］.宁波：2000：996.
       
       ［7］ 聂 纯.天然药物抗癌有效成分进展［J］.中草药.1999,30(1)：65.
       
       ［8］ 刘中博，王铁杰，文琪琚，等.RP-HPLC法测定薯蓣属植物中原薯蓣皂苷［J］.中草药.2006,37(7)：1097.