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       【摘要】 
       目的测定辣木叶中多糖的含量。方法采用精制辣木叶多糖测得辣木叶多糖对葡萄糖的换算因子后，采用蒽酮-硫酸比色法测定，测定波长为620 nm。结果韶关新丰引种栽培辣木中多糖含量为4.85%,供试液在4 h内显色稳定,平均回收率为 98.72%,RSD＝1.88%(n=4)。结论 此测定方法简便可行,可作为辣木叶中多糖的含量测定方法。
       【关键词】  辣木叶； 多糖； 蒽酮硫酸法
       Determination of Polysaccharide in Leaves of Moringa oleifera
       CHEN Ruijiao ,PENG Shanshan, WANG Yuzhen, LIANG Hanqiu
       (Yingdong College of Bioengineering, Shaoguan University, Shaoguan Guangdong, 512005, China)
       Abstract：ObjectiveTo determine the contents of polysaccharide in leaves of Moringa oleifera.  MethodsAfter the conversion coefficient of Moringa oleifera polysaccharides  to glucose was obtained, contents were determined by anthrone-H2SO4 colorimetry. Wavelength for measurement was 620nm. ResultsThe contents of Polysaccharide in leaves of Moringa oleifera planted in Shaoguan County of Guangdong Province was 4.85%,the color of the treated sample was stable in 4h and average value of the recovery for Polysaccharide measurement was 98.72% with 1.88% of RSD(n=4). ConclusionThe method used in this paper is simple. It can be used for determination of the polysaccharide in leaves of Moringa oleifera.
       Key words：Leaves of Moringa oleifera；  Polysaccharides ;   Anthrone-sulfuricacid method
       
       辣木Moringa oleifera为辣木科辣木属植物，原产于印度北部喜马拉雅区域［1］，全株均可利用，叶、花、豆荚富含蛋白质、维生素A、维生素B6、维生素C、维生素E、叶酸、泛酸及钙、钾、铁等营养成分，不仅是发达国家素食者的理想食物，还是贫穷地区妇女和儿童的天然营养库。印度传统医学认为，辣木叶有护肝、利尿、消炎、止痛、降压、强心、催乳等功效。常用来预防和治疗糖尿病、高血压病、皮肤病、免疫力弱、贫血、坏血病、肥胖症、关节炎、消化器官肿瘤等疾病［2］。
       
       植物多糖是由许多相同或不同的单糖以α或β糖苷键所组成的化合物,普遍存在于自然界植物体中,大量研究表明多糖除了有调节免疫功能、抗肿瘤的生物学效应外,还具有降血糖、降血脂和降胆固醇等生理功能。近年来，辣木在我国广东、云南和海南等都有引种栽培，其活性成分研究和产品的开发成为热点。本文用精制辣木叶多糖测得辣木叶多糖对葡萄糖的换算因子，然后将经90%乙醇处理脱杂后的辣木叶用水提取多糖，蒽酮－硫酸法比色测定，该法准确性好、简便可行。为辣木的合理开发和利用提供了科学依据。
       1  材料
       1.1   原料辣木叶采自韶关市新丰县东林农业开发有限公司种植场。50℃干燥后，粉碎，过40目筛，备用。
       1.2  试剂蒽酮、浓硫酸、无水乙醇、丙酮等均为国产分析纯；葡萄糖对照品为分析纯；AB-8型大孔树脂购于天津南开大学。
       1.3  仪器HH-W420数显三用恒温水浴锅（江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司）；R201旋转蒸发器（上海申生科技有限公司）；SHZ－3循环水真空泵（上海华光仪器仪表厂）；3K18 超速冷冻离心机（美国 Sigma公司）；Ultrospec 2000 紫外/可见分光光度计（Amersham Pharmacia Biotech公司）。
       2  方法
       2.1  辣木叶多糖的提取与精制称取辣木叶粉60 g，分别加20，15，10倍蒸馏水(w / w)于80℃水浴上提取3次，1.5 h/次，过滤，合并滤液，离心分离（4 000 r/min，4℃，10 min），上清液浓缩至一定体积后，Sevage法除蛋白，反复进行8次至无蛋白层，采用 H2O2氧化法去色素。然后逆流水透析48 h，蒸馏水透析24 h，透析液浓缩，上AB-8型大孔吸附树脂柱，以蒸馏水洗脱，洗脱至洗脱液加入95%乙醇无沉淀为止。将洗脱液浓缩至小体积后加入无水乙醇使含醇量达到80%，于4℃冰箱中过夜醇沉，再离心分离（4 000 r/min，4℃，10 min），沉淀依次用无水乙醇、丙酮反复洗涤多次，50℃低温干燥至恒重，即得精制辣木叶多糖。称重，计算得率，备用。
       2.2  标准曲线的绘制［3］
       2.2.1   标准溶液的配制精密称取干燥至恒重的葡萄糖0.100 0 g，以蒸馏水定容至100 ml的容量瓶中，摇匀，精密吸取该溶液10 ml于100 ml容量瓶中，用蒸馏水定容，摇匀，即得葡萄糖标准液，浓度为0.1 mg/ml。分别精密吸取储备液1，2，3，4，5 ml置10 ml容量瓶中，以蒸馏水稀释定容摇匀，得系列对照品溶液。
       2.2.2  蒽酮-硫酸试液的配制取0.2 g蒽酮，加100 ml浓硫酸，置于棕色瓶中，混合摇匀置于冰箱中（现配现用）。
       2.2.3  标准曲线的绘制精密吸取上述系列对照品溶液1  ml ，置于10 ml具塞试管中，冰水浴5 min，加入0.2%硫酸蒽酮试液4ml摇匀，立即置于沸水浴加热10 min，取出用冷水冷却至室温，室温放置10 min左右，于620 nm处测定吸收度，另精密吸取蒸馏水1 ml，同法操作，作为空白对照。以吸光度（A）为纵坐标，葡萄糖对照品浓度（C）为横坐标，得葡萄糖标准曲线(见图1)，线性回归得回归方程A = 5.811 4C + 0.002 4，相关系数r =0.999 0。
       图1  葡萄糖标准曲线（略）
       2.3  换算因子的测定精密称取干燥至恒重的精制辣木叶多糖0.010 0 g,用水溶解于100 ml容量瓶中,用蒸馏水稀释至刻度,摇匀得精制辣木叶多糖贮备液，精密吸取精制多糖贮备液1ml,蒽酮-硫酸法测定其吸光度（A），从回归方程求出精制辣木叶多糖贮备液中葡萄糖浓度,按下式计算换算因子。
       
       换算因子 f =W /（C·D）
       
       式中：W为称取多糖的重量(mg),C为精制辣木叶多糖贮备液中葡萄糖浓度（mg/ml）,D为多糖的稀释倍数。
       2.4  样品中辣木叶多糖的含量测定
       2.4.1  样品溶液的制备准确称取40目辣木叶粉末1.000 g，置索氏提取器中，加入90%乙醇回流提取7 h,药渣挥尽乙醇，连同滤纸于烧瓶中，加蒸馏水250 ml,80℃水浴加热提取1.5 h，趁热过滤，残渣用80℃热蒸馏水洗涤3次，洗液并入滤液中，冷却后移入500 ml容量瓶定容。
       2.4.2   样品溶液中辣木叶多糖含量测定精密吸取2.4.1所得样品溶液1 ml，用蒽酮-硫酸法测吸光度（A）。由回归方程计算供试液中葡萄糖浓度（C），按下式计算样品中辣木叶多糖含量。
       
       辣木叶多糖含量（%）=C×D×fW×1000×100%
       
       式中：C为样品溶液中葡萄糖浓度(mg/ml),D为样品溶液的稀释倍数，f为换算因子,W为供试辣木叶的重量(g)。
       2.5   稳定性实验精密吸取按2.4.1项下方法制备的样品溶液1 ml，按照2.2.3项下的方法测定吸光度（A），每隔1 h测定1次，连续4 h考察其稳定性。
       2.6   加样回收率测定精密吸取同批4份已知含量的辣木叶粉末（过40目筛）各1 g，精密加入精制多糖样品5 mg，然后按2.4.1项样品液的制备和2.2.3标准曲线项下方法测定吸收度（A），根据2.4.2项中得出的结果辣木叶中多糖的含量为4.85%，计算回收率。
       3  结果
       3.1  精制辣木叶多糖的得率   60 g干燥的辣木叶粉末制得精制辣木叶多糖（1.505±0.088）g，得率为 （2.508±0.147）%（n＝4）。
       3.2  换算因子　f =3.13。
       3.3  辣木叶多糖含量的测定结果    测得该辣木叶样品中多糖含量为4.85%。
       3.4  稳定性实验   测定结果见表1。结果表明样品溶液在4 h内显色基本稳定，其吸光度相对标准偏差RSD =4.31%。
       3.5   加样回收率  结果见表2。
       4  讨论
          
       蒽酮硫酸法是测定多糖含量的经典方法，本实验首先用90%乙醇回流以除去单糖、低聚糖、生物碱、苷类及其它醇溶性的干扰成分，再用水提取多糖成分。蒽酮－硫酸法测定辣木叶多糖的原理是辣木叶多糖在浓硫酸的作用下，先水解为单糖，迅速脱水形成糠醛衍生物，其与蒽酮缩合为蓝色化合物，该化合物颜色深浅与糖的浓度成正比。在620 nm处有特征吸收。本法简单，且供试液在4h内显色稳定,灵敏度高。
        
       表1  辣木叶多糖含量测定稳定性实验结果（略）
       表2   加样回收率测定结果（略）
       在多糖含量测定中，得到相应多糖对照品较困难，因多糖组成比较复杂，往往采用单糖如葡萄糖代替对照品，测定样品多糖的相对含量。本实验中采用Sevage法除蛋白，H2O2氧化法去色素，利用AB8型大孔吸附树脂柱对多糖进行纯化，获得比较纯净的多糖。然后用精制多糖计算葡萄糖与辣木叶多糖的换算因子，这样可避免用葡萄糖做标准引起的系统误差，结果准确真实。
       
       研究结果表明，韶关新丰引种栽培的辣木中多糖含量为4.85%。张涛等［5］采用苯酚－硫酸分光光度法测定辣木中多糖含量为15.36%，其测定结果与本研究有较大差异，原因可能与测定方法、辣木产地、辣木叶采集时间、采集部位等因素有关。
       【参考文献】
         　　［1］ 刘昌芬，李国华.辣木的研究现状及其开发前景［J］.云南热作物科技，2002，25（3）：20.
       
       ［2］ 张燕平,段琼芬,苏建荣. 辣木的开发与利用［J］.热带农业科学，2004，24(4)：42.
       
       ［3］ 张 涛,马海乐,钟慧慧. 分光光度法测定辣木多糖含量［J］.粮油食品科技，2004，12（1）：32.