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       【摘要】 
       目的通过溪黄草中二萜成分含量测定方法的建立及商品药材质量分析，为溪黄草质量标准的制定提供依据。方法采用RPHPLC法测定6,7去氢罗伊林酮和(15S)12,16环氧11,14二羟基8,11,13松香烷7酮的含量；流动相：0.05%三氟乙酸乙腈（25∶75），检测波长：210 nm；理论塔板数按6,7去氢罗伊林酮计算应不低于6 000，按(15S)12,16环氧11,14二羟基8,11,13松香烷7酮计算应不低于5 000。结果11批次的测试样品中6,7去氢罗伊林酮的含量范围在91.5～182.5 μg·g-1，(15S)-12,16环氧11,14二羟基8,11,13松香烷7酮的含量范围在35.4～84.2 μg·g-1，建议药材中6,7-去氢罗伊林酮和(15S)-12,16环氧11,14二羟基8,11,13松香烷7酮的含量限度分别不得低于113.4 μg·g-1和52.3 μg·g-1。结论 经过系统的方法学考察，所建立的测定方法具有操作简便、稳定、专属、可重复的特点，可用于溪黄草药材及含溪黄草的复方制剂的质量控制。
       【关键词】  溪黄草； 6,7去氢罗伊林酮； (15S)12,16环氧11,14二羟基-8,11,13松香烷7酮； 含量测定； 反相高效液相色谱法
       基金项目：国家自然科学基金资助项目(No.30672596)；广东省自然科学基金重点项目(No.036575)
       
       Determination of Two Ent-Kaurane Diterpenoids in Isodon lophanthoides var.gerardianus
       LIN Chaozhan，ZHU Chenchen*，YANG Jinyan
       （School of Pharmacy, Guangzhou University of TCM, Guangzhou  510006, China）
       Abstract：Objective To establish a method for determination of diterpenoids in different batches of the aerial part of Isodon lophanthoides var. gerardianus. MethodsAn RPHPLC method was established for the determination of 6,7Dehydroroyleanone and (15S)12,16Epoxy11,14dihydroxy8,11,13abietatrien7one by using Kromasil RPC18(250 mm×4.6mm，5μm) column, with a mixture of 0.05% trifluoroacetic acidAcetonitrile (25∶75) as mobile phase at the flow rate of 0.80 ml·min-1 and detection wavelength of 210 nm.ResultsThe contents of the above two diterpenoids showed great difference among the 11 patches of tested samples. The content of 6,7Dehydroroyleanone ranged from 91.5 to 182.5 μg·g-1 and that of (15S)12,16Epoxy11,14dihydroxy8,11,13abietatrien7one ranged from 35.4 to 84.2 μg·g-1. The suggested content limitation of 6,7-Dehydroroyleanone should be 113.4 μg·g-1, and that of (15S)12,16Epoxy-11,14dihydroxy8,11,13abietatrien7one be 52.3 μg·g-1 in the crude Isodon lophanthoides var.gerardianus.ConclusionThe established method has been proved to be simple, stable and repeatable, and can be applied for quality control of the crude Isodon lophanthoides var.gerardianus and compound prescriptions contained crude Isodon lophanthoides var.gerardianus.
       Key words：Isodon lophanthoides var.gerardianus；   6,7Dehydroroyleanone ；   (15S)12,16Epoxy11,14dihydroxy8,11,13abietatrien7one；  Content determination；  RPHPLC
       
       溪黄草为唇形科香茶菜属植物狭基线纹香茶菜 Isodon serra（Maxim）Hara的干燥全草，具有清热利湿、退黄、凉血散淤之功效，是我国南方地区治疗乙型肝炎的常用草药［1］，临床应用广泛，疗效确切，目前已有较多的以其为主要原料的养肝护肝中药制剂及保健品。该植物主要含有松香烷型二萜类（Abietane type）及乌索烷型三萜类成分(Ursane type) ［2］，迄今为止国内外学者报道已从中分离得到13种二萜和4种乌索烷型三萜，其中6个松香烷型二萜（Abietane type）分别为狭基线纹香茶菜甲素、乙素（Lophanthoidin A、B），11βhydroxyl8，15isopimaradiene 3one、Gerardianin A，Gerardianin B，Lophanic acid，1个半日花烷型二萜（Labdane type）即8(17),12,14Labdatriene19oic acid及6个二萜醌分别为16Acetoxy7O acetyl horminone，16Acetoxy12Oacetylhorminone，Royleanone，6,7-Dehydroroyleanone，Horminone，16Acetoxy7αmethoxyroyleanone；Ursolic acid，Olean acid，2αhydroxyl Ursolic acid，2α,19αdihydroxyl Ursolic acid等成分。有关溪黄草三萜类成分如熊果酸、2α羟基熊果酸［3，4］的含量测定，我们已有报道。然而对其所含成分种类众多、抗肿瘤活性作用［5，6］成分的测定，国内外尚无文献报道。我们通过前期系统的化学成分研究，分离纯化了两个二萜化合物6,7去氢罗伊林酮和(15S)12,16环氧11,14二羟基8,11,13松香烷7酮，并收集了广东地区市售商品药材，测定这两个二萜化合物的含量，以期为溪黄草质量体系的建立和完善提供科学依据。
       1  器材
       
       依利特P230双泵高效液相色谱仪(大连伊利特)，EC2000色谱工作站；Satorius电子分析天平（北京Satorius公司）。所用试剂均为分析纯，液相用乙腈为色谱纯，水为市售纯净水。溪黄草均为市售（见表1），并经广州中医药大学陈建南研究员鉴定学名为Isodon lophanthoides var.gerardianus（Benthan）H.Hara。
       
       6,7去氢罗伊林酮和(15S)12,16环氧11,14二羟基8,11,13松香烷7酮对照品为自制，并经光谱学鉴定及色谱法检测其纯度为99%以上。液相色谱纯试剂为MERCK公司出品，其余试剂均为国产分析纯。
       表1  溪黄草药材样品资料（略）
       2  方法与结果
       2.1  色谱条件 Kromasil RPC18色谱柱（4.6  mm×250 mm,5 μm）；流动相：乙腈0.05%三氟乙酸（75∶25）；流速:：0.8 ml/min;检测波长：210 nm;进样量：5 μl；理论塔板数按6,7去氢罗伊林酮计算应不低于6 000，按(15S)12,16环氧11,14二羟基-8,11,13松香烷7酮计算应不低于5 000。6,7去氢罗伊林酮和(15S)12,16环氧11,14二羟基8,11,13松香烷7酮的保留时间分别为18.20 min和48.38 min并且与其它组分分离良好。对照品和样品的高效液相色谱图见图1～2。
       a：6,7去氢罗伊林酮（6,7Dehydroroyleanone）
       b：(15S)12,16环氧11,14二羟基8,11,13松香烷7酮（(15S)12,16Epoxy11,14dihydroxy8,11,13abietatrien7one）
       图1  6,7去氢罗伊林酮和(15S)12,16环氧11,14二羟基-8,11,13松香烷7酮的HPLC分离图谱（略）
       图2  溪黄草药材的HPLC分离图谱（略）
       2.2  标准曲线的制备及线性范围考察  精密称取6,7去氢罗伊林酮和(15S)12,16环氧11,14二羟基8,11,13松香烷7酮对照品适量,加甲醇溶解并定溶,制成浓度分别为420 μg/ml, 360 μg/ml的储备液。分别精密量取一定体积的储备液于量瓶中,稀释成系列浓度的对照品溶液, 6,7去氢罗伊林酮稀释体积为0.05→10ml，0.1→2 ml，0.15→2 ml，.2→2 ml，0.3→2 ml，0.4→2 ml，0.5 ml→2 ml，加甲醇稀释到刻度,摇匀； XHC－5稀释体积为0.05 ml→10 ml，0.05→2ml，0.1→2 ml，0.2→2 ml，0.3→2 ml，0.4→2 ml，0.5 ml→2 ml, 加甲醇稀释到刻度,摇匀,备用。分别精密吸取上述系列浓度的对照品溶液各5 μl,依选定色谱条件进行测定,以峰面积(Y)对对照品质量(X)进行线性回归,得回归方程分别为: 6,7去氢罗伊林酮：Y=53.128X17.037，r=0.999 3,线性范围：10.5 ～525 ng； (15S)12,16环氧11,14二羟基8,11,13松香烷7酮：Y=43.54X+27.618, r=0.999 9, 线性范围：9～450 ng。
       2.3  样品溶液的制备  精密称取溪黄草药材1.0 g，加甲醇80 ml索氏提取至馏出液为无色（约3.5 h），提取液水浴蒸干，残渣以甲醇溶解并定容至10 ml，备用，进样前以0.20 μm的微孔滤膜过滤。
       2.4   稳定性实验 精密吸取样品溶液10 μl，分别于0，1，2，4，8，12，24 h进行测定。结果见表2。
       表2  稳定性实验结果（略）
       结果表明样品溶液放置24 h内稳定，故宜在24 h内完成测定。
       2.5  精密度实验 精密吸取样品溶液10 μl，连续进样5次。结果见表3。
       表3  精密度实验结果（略）
       2.6  重现性实验 精密称取溪黄草样品5份，余同2.3项下操作，进样前以0.20 μm微孔滤膜过滤。结果见表4。
       表4  重现性实验结果（略）
       2.7  加样回收率 精密称取同一已知6,7去氢罗伊林酮和(15S)12,16环氧11,14二羟基8,11,13松香烷7酮含量的溪黄草样品适量，再准确加入6,7去氢罗伊林酮和(15S)12,16环氧11,14二羟基8,11,13松香烷7酮对照品，余同2.3项下操作，进样10 μl，记录色谱图并计算结果。结果见表5。
       表5  6,7去氢罗伊林酮和(15S)12,16环氧11,14二羟基8,11,13松香烷7酮加样回收率结果（略）
       2.8  样品含量测定 精密称取11批次溪黄草1 g，余下操作同2.3项下操作，进样10 μl，记录色谱图并计算结果。结果见表6。
       表6  溪黄草中6,7去氢罗伊林酮和(15S)12,16环氧11,14二羟基8,11,13松香烷7酮含量测定结果（略）
       3  讨论
          
       有关溪黄草的质量分析，多为对其中三萜类成分的含量测定［3，4］，然而大量文献报道该药材主要含有二萜类成分，且该类成分也是其抗肿瘤活性的主要有效成分。因此，建立以有效成分群二萜类成分为溪黄草的质量控制体系，更能真实客观地反映其内在质量。我们在化学成分研究的基础上，建立针对溪黄草中的二萜成分的含量测定方法，并对所收集的11批次商品药材进行质量分析，以期为建立专属、可行的溪黄草质量标准提供科学依据。
       
       采用RPHPLC法，对11批次的溪黄草提取物中的6,7去氢罗伊林酮和(15S)12,16环氧11,14二羟基-8,11,13松香烷-7-酮进行测定，11批次的测试样品中6,7-去氢罗伊林酮的含量范围在91.5～182.5 μg·g-1， (15S)12,16环氧11,14二羟基8,11,13松香烷7酮的含量范围在35.4～84.2 μg·g-1。
       
       通过对6,7去氢罗伊林酮和(15S)12,16环氧11,14二羟基8,11,13松香烷7酮的紫外全波长扫描，可知两个对照品的紫外最大吸收均在210 nm。因此，本实验选择210 nm作为6,7去氢罗伊林酮和(15S)12,16 环氧11,14二羟基8,11,13松香烷7酮的检测波长，以保证这两个化合物在HPLC中有较高的响应值及灵敏度。
       
       对流动相系统经过反复多次的试验和摸索，曾尝试用甲醇－水、乙腈水、甲醇0.1%醋酸、乙腈0.1%醋酸、乙腈0.05%三氟醋酸等系统，发现在210 nm下，甲醇－水系统的基线噪音较严重，而乙腈系统较好。乙腈水系统基线漂移较严重，加0.1%醋酸有所改善，但6,7去氢罗伊林酮在此条件下很难洗脱（约需85 min），换成0.05%三氟醋酸，两组分的峰形得到较好改善，也有较好的分离度。最终确定乙腈0.05%三氟醋酸为溪黄草提取物中二萜成分含量测定的流动相系统。经过系统的方法学考察，所建立的方法具有稳定、简便、可重复的特点，可用于溪黄草提取物工艺的质量控制。
       【参考文献】
         　　［1］ 吴剑峰. 溪黄草的研究综述［J］.时珍国医国药，2003, 14(8)：498.
       
       ［2］ 孙汉董,许云龙,姜 北.香茶菜属植物二萜化合物［M］.北京：科学出版社，2001：4.
       
       ［3］ 吴剑锋，刘 斌，祝晨蔯，等．不同采收期溪黄草中2α羟基熊果酸含量的动态研究［J］.中草药，2004, 31(1)：81.
       
       ［4］ 吴剑锋，刘 斌，祝晨蔯，等．不同施肥区域溪黄草中2α羟基熊果酸含量的比较［J］.药学进展，2004, 28(7)：318.
       
       ［5］ 孙汉董，许云龙，秦崇秋，等．抗癌植物冬凌草的研究［J］.云南植物研究，1981,3(1)：95
       
       ［6］ 李继成，刘晨江，安新宗，等．毛叶香茶菜抗癌成分研究［J］.药学学报，1982,17(9)：1682.