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       【摘要】 
       目的研究峨眉山不同海拔高度鱼腥草居群槲皮素含量差异。方法用Hypersil ODS C18(5 μm，4.0 mm×250 mm)色谱柱，流动相为乙腈：0.4%磷酸=45∶55，调pH=3，流速1.0 ml/min，柱温30℃，紫外检测波长370 nm。结果该法简便、快速、准确，可作为鱼腥草中槲皮素的定量分析方法。结论不同海拔的9个鱼腥草居群槲皮素含量存在显著差异，其含量与海拔高度及土壤养分含量间相关性均不显著。
       【关键词】  鱼腥草； 槲皮素； 海拔； 土壤养分； 反相高效液相色谱
       基金项目：四川省教育厅重点项目（No.2003A011）；教育部留学回国人员科研启动基金资助项目
       Variations on the Quercetin Content of Houttuynia cordata Thunb. Populations from Different Altitudes of Mt.Emei
       LIU Lei, WU Wei*, ZHENG Youliang, WU Shan
       (Agronomy College of Sichuan Agricultural University, Yaan, Sichuan 625014, China)
       Abstract：ObjectiveTo study the difference of quercetin content of H.cordata Thunb. from different altitudes of Mt.Emei.MethodsQuercetin was determined by HPLC on Hypersil ODS C18(4.0 mm×250 mm, 5 μm) at 30℃ with acetonitrile:0.4% phosphoric acid(45∶55),pH=3 as the mobile phase.Detection wavelengh was 370 nm.The flow rate was 1.0 ml/min.Results This method is simple, fast and accurate, and can be the quantitative analytic method of quercetin content of H. cndata.ConclusionThere are significant differences among the quercetin content of 9 populations from different altitudes.The correlationship between quercetin content and altitudes and soil nutrient are not significant.
       Key words：Houttuynia cordata Thunb.;  Quercetin;  Altitude;  Soil nutrient;  RPHPLC
       
       鱼腥草是三白草科蕺菜Houttuynia cordata Thunb.之全草。广泛分布于于我国中部、东南及西南部各省区，尤以四川、湖北、湖南、江苏等省居多。性味辛、寒，具有清热解毒、消肿排脓、利尿通淋之功效。鱼腥草除含挥发油成分外，还含大量槲皮素、槲皮苷、异槲皮苷等。其中槲皮素具有祛痰、止咳平喘、抗炎、抗过敏、扩张冠脉、降血脂、抗心律失常、抗血小板聚集、抗氧化、抗肿瘤等广泛的药理作用［1］，其含量是衡量鱼腥草药用价值的重要指标。
       
       峨眉山地处中国四川盆地西南边缘，形成于距今3 000万年前的喜玛拉雅运动。山体为近南北走向的山脉，山顶最高海拔为3 099 m。峨眉山气候温和，云雾多，日照少，雨量充沛，空气相对湿度大，存在着丰富的植物资源。根据我们以前的调查，峨眉山鱼腥草资源非常丰富，主要分布在海拔500～1 800 m范围内。
       
       近年来，国内对鱼腥草的研究报道主要集中在生产栽培、药理药效、临床应用和遗传背景［2～5］等方面。曾有学者对一些植物的次生代谢产物与海拔高度间关系进行过研究［6，7］，多数结果表明次生化谢产物与海拔高度间存在显著或极显著的相关性。也有学者对植物次生代谢产物与土壤养分间的关系进行过研究［8］，结果表明土壤养分对植物次生代谢产物的合成量也有显著影响。先前，笔者曾对峨眉山不同海拔高度鱼腥草居群挥发油成分进行过研究，发现挥发油中部分成分与海拔高度和土壤养分间存在显著相关性（生态学报，待发表）。本研究则采用反相高效液相色谱法测定了不同海拔9个鱼腥草居群槲皮素含量，探讨海拔高度及土壤养分与槲皮素含量间的关系，通过对次生代谢产物与海拔高度及土壤养分的综合评价，为鱼腥草人工栽培选择适宜的海拔高度和土壤条件以及进一步的合理开发利用提供一定的理论依据。
       1  仪器与试药
       
       Agilent 公司1100型高效液相色谱仪（含脱气机、四元梯度泵、自动进样器、柱温箱、DAD检测器），Sartorius公司BP211D型电子天平，ICE公司Micromax型离心机，Millipope公司MilliQ型纯水仪。
       
       乙腈为色谱纯，由TEDIA公司提供，槲皮素对照品（纯度＞98%）由Sigma公司提供，其余试剂为分析纯。
       表1  试验材料的采集地点、海拔高度、生长期环境及多度（略）
       2  材料与方法
       2.1  试验材料由于在峨眉山海拔1 800 m以上的地区已很难采集到鱼腥草，本试验所有居群的材料均采自海拔1 800 m以下。9个居群材料和生长地土样于20050713采自峨眉山西坡。各居群的海拔高度、生长环境及多度见表1。经四川农业大学吴卫博士鉴定均为Houttuynia cordata Thunb.。
       2.2  峨眉山鱼腥草生长地土壤养分含量基本情况峨眉山鱼腥草生长地土壤养分含量的基本情况见表2。土样的处理和各种营养元素的分析参照《土壤农化分析》中的常规方法进行。
       2.3  色谱条件色谱柱：Hypersil ODS C18（ 5 μm，4.0 mm×250 mm）；流动相：乙腈∶0.4%磷酸=45∶55，调pH=3。流速：1.0 ml/min；柱温：30℃；紫外检测波长：370 nm；槲皮素对照及供试样品分离色谱图见图1。
       表2  峨眉山鱼腥草生长地土壤养分含量（略）
       表中所列数据为3次测定结果的平均值，“/”表示因试验原因未检测出
       图1  槲皮素对照及供试样品分离色谱图（略）
       2.4  标准溶液制备精密称取槲皮素对照，无水乙醇定容至50 ml，配成浓度为224.3 μg/ml的对照溶液，再稀释配成浓度为22.43 μg/ml 的对照溶液。
       2.5  供试样品制备将干燥后的材料粉碎过40目筛，精密称取1 g置50 ml具塞三角瓶，加入提取液（乙醇：25%盐酸=4∶1）30 ml后超声提取40 min，分两次进行，20 min/次，中间间隔10 min。取出过滤，残渣用提取液洗涤数次，定容至50 ml。取1.0 ml至1.5 ml离心管中，1 000 r/min离心10 min，取上清液作为供试品样品。
       2.6  样品测定方法准确吸取供试品溶液5 μl，注入高效液相色谱仪，按上述色谱条件，依法测定。
       2.7  线性范围取浓度为22.43 μg/ml和2243 μg/ml的槲皮素对照品溶液，分别进样1，2，5，10 μl，按上述色谱条件测定，以峰面积为纵坐标，槲皮素的浓度（μg/ml）为横坐标，绘制标准曲线，计算得回归方程为：Y=1.261 458X-16.121 8，r=0.999 7。表明槲皮素含量在22.43～2 243 ng范围内具有良好的线性关系。
       2.8  精密度试验精密吸取22.43 μg/ml对照品溶液5 μl，重复进样5次，槲皮素峰面积积分值的相对标准偏差RSD=0.30%。
       2.9  稳定性试验精密吸取22.43 μg/ml对照品及供试样品溶液5 μl，分别在0，3，6，9 h进样测定，对照品和供试样品的槲皮素峰面积相对标准偏差RSD分别为0.96%和0.99%。结果表明对照品及供试品在9 h内有良好的稳定性。
       2.10  重复性试验取同一样品6份，按上述样品制备方法和色谱条件测定，槲皮素含量相对标准偏差RSD=1.61%。
       2.11  回收率试验取已知含量样品加入对照品适量，依法测定，结果平均回收率为101.19%，RSD为2.35%（n=6）。
       3  结果与分析
       3.1  峨眉山鱼腥草居群槲皮素含量的基本情况每份材料按2.5项方法重复3次，分别精密吸取供试品溶液各5 μl，按上述色谱条件测定，计算样品中槲皮素含量，样品测定的平均结果见表3。
       
       9个居群材料间槲皮素含量变幅为0.24～2.36 mg/g，平均含量1.17 mg/g。方差分析结果表明，各居群材料槲皮素含量差异的F值为358.04，大于F0.01=3.89，达极显著水平。从新复极差法多重比较结果可以发现，除C3与C4两居群材料的槲皮素含量差异不显著外，其余任意两居群间槲皮素含量的差异均达到1%的显著水平。
       表3  峨眉山不同海拔高度鱼腥草居群槲皮素含量和多重比较结果（略）
       3.2  槲皮素含量与海拔高度间的关系相关分析结果表明，各居群材料槲皮素含量与海拔高度的相关系数为0.215 2，相关性不显著。
       3.3  槲皮素含量与生长地土壤pH值和养分含量间关系槲皮素含量与其生长地土壤pH值间的相关系数为-0.437 5，未达显著水平。与有机质和各种养分分的相关性也均不显著。其相关系数的依次为：有效硼（0.607 2）、有效锌（0.394 4）、有效锰（0.304 6）、全氮（-0.256 6）、有效钼（0.223 8）、有机质（0.205 2）、有效铁（-0.189 9）、速效钾（0.087 3）、碱解氮（0.035 8）和有效铜（-0.034 8）。
       4  讨论
       4.1  刘文尧等曾利用高效液相色谱法对购于河北安国和北京的4份鱼腥草材料进行过槲皮素含量测定，其含量变幅为2.0～4.3 mg/g，平均3.4 mg/g。本项目组陈黎等利用相同的方法对来自全国各地的26份鱼腥草材料进行了槲皮素含量的测定，其含量变幅为0.59～4.02 mg/g，平均1.8 mg/g（待发表）。而本试验结果表明，峨眉山鱼腥草居群槲皮素含量为0.24～2.36 mg/g，平均1.17 mg/g，总体水平偏低。究其原因，可能与我国鱼腥草种质源极为丰富，遗传背景各不相同，加之不同居生长地生态环境差异较大有关。
       4.2  曾有学者对植物次生代谢物与海拔高度及土壤养分含量等生态因素间的关系进行过研究。结果表明，山茛菪中樟柳碱和总生物碱含量海拔高度的升高而增加，东莨菪碱、山茛菪碱和阿托品则与海拔高度的相关性不显著；紫菀中的类黄酮的酚类物质随海拔高度的增加而增加；生长于高海拔、肥沃砂质土壤的鲜缬草含油量高［6］；土壤微量元素会影响杜仲叶中次生代谢物合成与积累。笔者先前的研究也发现，峨眉山不同海拔高度鱼腥草居群挥发油中乙酸龙脑酯和柠檬烯的含量与海拔高度间存在显著相关性，土壤养分对部分挥发油成分含量也有显著影响（生态学报，待发表）。本研究则发现，鱼腥草槲皮素含量与海拔高度及土壤养分含量间相关性均不显著。
       4.3  本试验所检测的9个鱼腥草居群位于海拔500～1 600 m间，尽管鱼腥草槲皮素含量与海拔高度及土壤养分含量间相关性均不显著。但试验结果也表明，除C3和C4两居群槲皮素含量差异不显著外，其余各居群差异均达到1%的显著水平。即使位于同一海拔（1 400 m）的两个不同山峪的鱼腥草居群C1和D1，其槲皮素含量差异也很大，分别为2.36 mg/g和0.79 mg/g。其产生原因推测可能与峨眉山地形复杂，生态条件变化较大，小生境分化强烈有关。
       【参考文献】
         　　［1］ 王艳芳，王新华，朱宇同.槲皮素药理作用研究进展［J］.天然产物研究与开发，2003，15（2）：171.
       
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       ［6］ 薛存宽，蒋 鹏，沈 凯，等.缬草挥发油成分分析及其含量影响因素探讨［J］.中草药，2003，34（9）：779.
       
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       ［8］ 吴炳辅，崔万钧.中药中微量元素研究的现状和展望［J］.中草药，1986，17（4）：38.