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       【摘要】 
       目的通过体外细胞培养技术，探讨开口箭提取物的细胞毒活性，为进行深层次研究提供依据。方法采用四甲基偶氮唑盐（MTT）比色法。结果开口箭甲醇提取物、总皂苷、30%总皂苷和70%总皂苷对HL-60和Caski细胞的抑制作用显著，与阴性对照相比（P<0.05）,对HL-60细胞的抑制率达到60.12%，72.25%，89.09%，95.17%，其IC50为65.57，45.07，35.40，22.89 μg/ml。对Caski细胞的抑制率达到63.94%，71.48%，62.49%，73.43%，其IC50为108.42，84.53，41.02，47.19 μg/ml。结论开口箭提取物对HL-60和Caski细胞具有明显的抑制作用。
       【关键词】  开口箭； 皂苷； MTT法； 细胞毒活性
       基金项目：三峡大学重大科研资助项目（No.2005ZD007）；　神农架林区政府科技攻关资助项目（No.SDH200221）
       
       The Studies on the Cytotoxicities of the Extracts of Tupistra chinensis Bak.
       LI Qing, ZOU Kun*, WANG Junzhi
       (Hubei provincial Key Laboratory of Natural Product Research and Development, College of Chemistry and Life Science, Three Gorges University, Yichang, 443002，China)
       Abstract：ObjectiveTo observe the cytotoxicities of the extracts of Tupistra chinensis Bak. with in vitro cell culture technology, and provide evidence for the further research.MethodsThe cytotoxicities were assayed by MTT methods on HL-60 and Caski tumor cells. ResultsThe inhibition effect of the extracts of Tupistra chinensis Bak., total saponins, 30% total saponins and 70% total saponins on HL-60 and Caski cells were all prominent, compared with the negative model group (P<0.05). Their inhibition ratios on HL-60 tumor cells were as follows: 60.12%,72.25%, 89.09% and 95.17%，and their IC50 were 65.57, 45.07, 35.40 and 22.89μg/ml. Their inhibition ratios on Caski cells were 63.94%, 71.48%, 62.49% and 73.43%，and their IC50 were 108.42,84.53,41.02,47.19 μg/ml. Conclusion The extracts of Tupistra chinensis Bak. have significant cytotoxicity on HL-60 and Caski tumor cells.
       Key words：Tupistra chinensis Bak.；  Saponin；  MTT method；  Cytotoxicity
       
       开口箭（Tupistra chinensis Bak.）系百合科Liliaceae铃兰族开口箭属植物，为著名的传统中药，主治劳热咳嗽、跌打损伤、风湿痹痛等症，民间用于治疗咽喉炎、扁桃体炎等。现证明开口箭具有祛痰、抗炎、抑菌及醒酒作用［1，2］。
       
       本实验室通过实验证实湖北省产开口箭含有甾体皂苷和甾体皂苷元,且含量较高［3］。皂苷具有增强免疫功能、抗辐射、抑制肿瘤生长、抗炎、降血糖等广泛的生物学活性,近年越来越受人们的普遍关注。有研究证实开口箭同属植物皂苷成分有细胞毒活性［4，5］。本文旨在通过体外抗肿瘤实验,观察开口箭提取物对HL-60和Caski细胞的细胞毒活性,现报告如下。
       1  材料
       1.1  细胞株人急性淋巴细胞性白血病细胞（HL-60）、人宫颈鳞状上皮癌细胞(Caski)均由三峡大学免疫教研室提供。
       1.2  药品与仪器RPMI-1640为美国GIBCO公司产品；新生小牛血清为杭州四季青生物材料有限公司产品；HEPES为美国Sigma公司产品，胰蛋白酶为美国GIBCO公司产品；四氮唑蓝(MTT)为美国AMRESCO公司产品；丝裂霉素 (MMC，浙江海正药液股份有限公司，批号：051211)；酶联免疫检测仪(GENIOS TECAN)；CO2培养箱（日本三洋公司）；LD4-2A离心机(北京医用离心机厂)；96孔板(美国Cornning公司)。
       
       开口箭根茎于2002-07采自湖北省神农架林区，经三峡大学化学与生命科学学院陈发菊副教授鉴定为Tupistra chinensis Bak.，标本存放于湖北省天然产物研究与利用重点实验室（编号：TC200207SNJ）。
       1.3  药物制备开口箭根茎粉碎后，用甲醇回流提取3次，合并3次提取液，浓缩后经石油醚脱脂用水饱和的正丁醇萃取，旋转蒸发回收正丁醇，浓缩液抽干后即得到开口箭总皂苷，配成水液，过大孔树脂柱，水洗， 30%乙醇、70%乙醇、95%乙醇梯度洗脱，得开口箭四部分皂苷。
       
       分别取开口箭甲醇提取物、开口箭总皂苷、30%开口箭皂苷、70%开口箭皂苷4个样品，用含10%灭活的新生小牛血清RPMI-1640培养液将其配制成所需浓度，依次为62.5,125,250,500,1 000,2 000 μg/ml。丝裂霉素(MMC)用含10%灭活的新生小牛血清RPMI-1640培养液将其配置为250 μg/ml。所有受试样品均用0.22 μm微孔滤膜过滤除菌。
       2  方法
       2.1  细胞培养HL-60 和Caski细胞用RPMI-1640培养液（另加10mmol/L HEPES,2.0 mg/ml NaHCO3，100 U/ml青霉素，100 μg/ml链霉素和10%新生小牛血清），于CO2孵箱中37℃，5%CO2饱和湿度下培养。贴壁细胞用含0.02%EDTA的0.25%胰蛋白酶消化传代。
       2.2   MTT比色法［6］按Mosmann氏法略加改进。将处于对数生长期的细胞制成单个细胞悬液，调整细胞浓度为0.8×105个/ml,接种于96孔培养板,每孔接种180 μl，转板6 h后加20 μl受试药,另设阴性对照组(不加药)、空白凋零组（只有培养基）和阳性对照组（MMC组），每组均设6个复孔，培养48 h后加MTT(5 mg/ml)15 μl,继续培养4 h后,弃去上清液，加DMSO 100 μl,用全自动酶联免疫检测仪于492 nm波长处测定吸光度(OD)值［7］,求出IC50。抑制率（%）=［1-（实验组OD均值-空白组OD均值）/(对照组OD均值-空白组OD均值）］×100%。
       2.3  统计学处理 实验数据以±s表示，数据分析采用SPSS11.5统计软件进行。用Origin软件，通过半对数拟合直线求IC50值。
       3  结果
       3.1  开口箭总提取物和总皂苷对HL-60细胞的影响结果见表1。
       表1  总提取物和总皂苷对HL-60细胞的抑制作用（略）
       与阴性对照组比较，*P<0.05，**P<0.01；n=6
       
       由表1可知开口箭总提取物和总皂苷对HL-60细胞的抑制作用显著，与阴性对照组相比有显著性差异（P<0.05或P<0.01），且呈良好的量效关系,总皂苷的抑制作用强于总提取物。
       3.2  开口箭30%总皂苷和开口箭70%总皂苷对HL-60细胞的影响结果见表2。
       表2  30%总皂苷和70%总皂苷对HL-60细胞的抑制作用（略）
       与阴性对照组比较，*P<0.05 ，**P<0.01；n=6
       
       由表2可知开口箭30%总皂苷和70%总皂苷对HL-60细胞的抑制作用显著，与阴性对照组比有显著性差异（P<0.05或P<0.01）。30%总皂苷最佳浓度为25 μg/ml，其抑制率达89.09%，70%总皂苷对HL-60细胞的抑制作用虽药物浓度的增加而增大，量效关系明显。
       3.3  开口箭总提取物和总皂苷对Caski细胞的影响结果见表3。
       表3  开口箭总提取物和总皂苷对Caski细胞的抑制作用（略）
       与阴性对照组比较，*P<0.05 ，**P<0.01；n=6
       
       由表3可知开口箭总提取物和总皂苷对Caski细胞抑制作用明显，与阴性对照组比有显著性差异（P<0.05或P<0.01）,呈良好的量效关系，总皂苷的抑制作用强于总提取物。
       3.4  开口箭30%总皂苷和70%总皂苷对Caski细胞的影响结果见表4。
       表4  30%总皂苷和70%总皂苷对Caski细胞的抑制作用（略）
       与阴性对照组比较，**P<0.01；n=6
       
       由表4可知，开口箭30%总皂苷和70%总皂苷对Caski细胞抑制作用显著，与阴性对照组比有显著性差异（P<0.05或P<0.01）,呈现一定的量效关系。
       4  讨论
       
       以上结果表明，开口箭甲醇提取物、总皂苷、30%皂苷和70%皂苷对体外培养的HL-60和Caski细胞株的抑制作用显著，与阴性对照组比均有显著性差异（P<0.05或P<0.01），其细胞毒作用呈现较明显的剂量依赖性。其中30%开口箭皂苷在25 μg/ml时与同浓度下丝裂霉素作用于HL-60细胞的效果相当，70%开口箭皂苷在50 μg/ml与丝裂霉素在25 μg/ml浓度下作用于HL-60细胞的效果相当。药理实验显示开口箭毒副作用小，因此开发其细胞毒作用有潜在价值。
       
       开口箭总皂苷上大孔树脂柱所得95%开口箭皂苷部分量较少，目前正在研究之中。至于不同的开口箭部位细胞毒活性存在差异，应与它们所含不同皂苷成分有关，还需要对其进行深入研究。
       
       从植物中寻找抗肿瘤药物及抗肿瘤辅助药物，在国内外均为抗肿瘤药物研究的重要组成部分。据文献报道开口箭对HepG2和S180细胞株亦有明显的抑制作用［8］,本实验室发现开口箭对HL-60和Caski细胞有较强的细胞毒作用，可见开口箭具有广谱抗肿瘤作用，此外开口箭还有祛痰抗炎等作用。因此对开口箭的抗肿瘤作用及机制值得进一步研究。
       【参考文献】
         　　［1］ 杨春艳,邹 坤,杨兴海,等.开口箭祛痰、抗炎和抑菌实验研究［J］.中国民族民间医药杂志,2005，2:103.
       
       ［2］ 汤子春,邹 坤,汪鋆植,等.开口箭与筒鞘蛇菰提取物的醒酒作用的实验研究［J］.时珍国医国药,2006,17(11):2163.
       
       ［3］ 黄 丽,廖全斌,邹 坤,等.开口箭中甾体皂苷元含量的测定［J］.三峡大学学报·自然科学版,2003,25(6):562.
       
       ［4］ 沈 平，王三龙,杨崇仁,等.弯蕊开口箭中的多羟基甾体皂甙元［J］.植物学报,2003,45(5):626.
       
       ［5］ Pan W b,Chang FR, Wei LM, et al. New flavans, spirostanol sapogenins, and a pregname genin from Tupistra chinensis and their cytotoxicity［J］. J. Nat. Prod.,2003,66(2):161.
       
       ［6］ 司徒镇强,吴军正.细胞培养,第1版［M］.西安:世界图书出版公司,2004:199.
       
       ［7］ 徐叔云.药理实验方法学,第3版［M］.北京:人民卫生出版社,2002：1762.
       
       ［8］ 朱正光,余传林,蔡 晶,等.开口箭提取物的抗肿瘤作用研究［J］.中药材,2006,29(3):277.