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       【摘要】 
       目的研究玉郎伞多糖(YLS)对H2O2诱导大鼠原代肝细胞损伤的保护作用及其机理。方法采用IV型胶原酶灌流法分离大鼠肝细胞进行原代培养，用H2O2体外诱导肝细胞损伤，检测培养上清液中AST和ALT水平，测定肝细胞中MDA和 GSH含量，MTT法检测细胞存活和增殖活性。结果YLS （0.125～1 mg/ml）可明显降低或恢复由H2O2升高的培养上清液中AST和ALT水平及肝细胞中MDA含量，还可提高H2O2降低的肝细胞存活率和GSH含量。结论 提示YLS对大鼠原代培养肝细胞损伤有直接保护作用，该作用可能与其抗氧化作用有关。
       【关键词】  玉郎伞多糖； 肝细胞； 过氧化氢； 抗氧化作用
       基金项目：广西自然科学基金项目（No.9912038）
       Protective Effects of Yulangsan Polysaccharide(YLS) on Primary Cultured Rat Hepatocytes Injury Induced by H2O2
       DUAN Xiaoqun, JIAO Yang, ZHANG Shijun, HUANG Renbin
       (Department of Pharmacology, Guilin Medical College ,Guilin 541004,China；Department of Pharmacology, Guangxi Medical University ,Nanning 530021,China)
       Abstract：ObjectiveTo study the protective effect and its mechanism of Yulangsan  polysaccharide(YLS) on primary cultured rat hepatocytes injury induced by H2O2. MethodsThe primary rat hepatocytes were isolated by perfusion with IV collaganase and injured by H2O2. The contents of malondialdehyde(MDA) and glutathion(GSH) in hepatocytes and the levels of AST and ALT in cultural supernatant were determined by general methods. Cell viability was assayed by MTT method. ResultsThe elevation of MDA content in hepatocytes and AST and ALT levels in supernatant of cultural hepatocytes , and the decrease in cell viability and GSH content induced by H2O2 were restored remarkably by the treatment with YLS（0.125～1 mg/ml）.ConclusionThe results suggest that YLS possesses direct protective action on primary hepatocyte injury induced by H2O2. This might be associated with the anti-oxidative activity of YLS.
       Key words：Yulangsan Polysaccharide(YLS);   Hepatocyte;   H2O2 ;   Anti-oxidative activity
       
       玉郎伞是一种尚未开发利用的民间草药，为蝶型花科植物疏叶岩豆 Millettia pulchra Kurz var. laxior(Dunn)Z Wei 的块根。具有散淤、消肿止痛之功能，民间用于高血压、肝炎、消化不良等的治疗，本课题组经多年研究证实玉郎伞提取物具有抗氧化和免疫调节作用，并对急、慢性实验性肝损伤均有明显的保护作用［1，2］。玉郎伞多糖（Yulangsan  Polysaccharide YLS）是玉郎伞提取物中主要的有效成分，为进一步研究YLS对肝损伤的作用，本文采用IV型胶原酶灌流法分离肝实质细胞进行体外培养，用过氧化氢(H2O2)诱导肝细胞损伤模型进行体外研究，观察YLS对体外肝细胞损伤的保护作用及其机制。
       1  器材
       1.1  动物  Wistar大鼠，雌雄不拘，体重(230±30)g；由广西医科大学实验动物中心提供。实验动物生产许可证：SCXK 桂20030003，实验动物使用许可证：SYXK 桂20030005。
       1.2   药物及试剂 YLS，由本室自行提取（分离得到的YLS多糖经Sephadex-75凝胶柱层析，硫酸-苯酚法以及高效凝胶渗透色谱法证实为高纯度多糖，纯度95%，紫外扫描显示无核酸和蛋白特征吸收峰，薄层色谱和气相色谱表明由葡萄糖和阿拉伯糖组成，红外光谱显示有典型的多糖吸收峰）；IV型胶原酶(Sigma公司)；RPMI1640(Gibco公司)；胎牛血清(杭州四季青公司)；H2O2(重庆川江化学试剂厂)；维生素E(Sigma公司)；台盼蓝(SigmaT6146，北京拜尔迪生物公司分装)；噻唑蓝（MTT，Amerisco，北京拜尔迪生物公司分装）；DHanks缓冲液（自配）；Hanks缓冲液（自配）；二甲基亚砜（DMSO，天津化学试剂有限公司）；天门冬氨酸转换酶(AST)、丙氨酸氨基转换酶(ALT)试剂盒（南京建成生物工程研究所）；丙二醛(MDA)试剂盒（南京建成生物工程研究所）；谷胱甘肽(GSH)试剂盒（南京建成生物工程研究所）。
       1.3   仪器  HL2型恒流泵（上海精科实业有限公司）；CO2恒温培养箱（美国Thermo Forma，Model 311）；TDL802B台式离心机（上海安亭科学仪器厂）；XD-101倒置显微镜（南京江南光电集团股份有限公司）； SZX型超净工作台（上海浦东跃欣科学仪器厂）；722 s型可见分光光度计（上海精密科学仪器有限公司）；450型酶标仪（美国BioRad）。
       2  方法
       2.1  大鼠原代肝细胞的分离及原代培养 ［3，4］大鼠用20%乌拉坦腹腔麻醉后，固定四肢，腹部消毒后，无菌操作下，打开腹腔，将肠管推向左侧，暴露门静脉和下腔静脉，小心分离穿线各一根，门静脉穿刺静脉留置针，退出针芯，结扎牢固。将留置管连接输液管，开启恒流泵，灌流37℃预热DHank"s液，流速15 ml/min，迅速剪开下腔静脉放血。同时打开胸腔暴露并结扎上腔静脉。灌流约10 min后，肝脏颜色呈黄白色。下腔静脉插入硅胶管，结扎牢固。改用含0.05% IV型胶原酶的Hanks液（37℃预热）15 ml/min，约15 min后，肝脏软化，压之凹陷不易恢复，迅速取下完整肝脏，连同含胶原酶灌流液置于平皿中，剔除肝包膜，轻柔摆动肝组织，让细胞慢慢游离出来，200目筛过滤得细胞悬液。600 r/min离心，弃上清，沉淀加1640培养液吹打混匀，800 r/min离心，共洗涤两次。用血球计数板（台盼蓝拒染法）测定细胞活率及细胞密度。用1640培养液调整细胞密度为5×105/ml，肝细胞活力大于90%。将上述肝细胞悬液加入96孔和24孔培养板中，置37℃，5%CO2培养箱中培养12 h后，肝细胞全部贴壁生长，供试验用。
       2.2   YLS对H2O2诱导肝细胞损伤的作用［5,6］维生素E作阳性对照，用少量DMSO溶解，加入到培养液后其终浓度为50 μmol/ml。
       
       取上述贴壁生长的肝细胞，设H2O2模型组、YLS（0.125～1）mg/ml 4个剂量组和空白对照组、维生素E组，每组至少设6个复孔。分别加入H2O2 0.6 mmol/L，不同浓度的YLS,维生素E和溶媒，继续培养24 h后，收集培养上清检测AST,ALT活性；弃肝细胞培养上清，加入0.2 ml Triton-100水溶液0.5 ml，混匀，2 500 r/min离心10 min，取上清测定肝细胞MDA和GSH含量，同时用MTT比色法，测定肝细胞的活率。
       2.3   MTT比色法待测细胞悬液于96孔培养板培养24 h后，各孔加入20 μl MTT试剂，轻轻混匀，继续37℃培养4 h，吸出全部液体，加200 μl DMSO，微量振荡器上振荡15 min，待溶解完全，于酶标仪570 nm波长比色。
       2.4   赖氏法测定AST和ALT按试剂盒说明测定。
       2.5   MDA和GSH含量测定按试剂盒说明测定。
       2.6   数据处理  所有数据均以±s表示，采用t检验进行统计处理。
       3  结果
       
       结果见表1。
       3.1   YLS对H2O2损伤肝细胞ALT和AST活性的影响  H2O2损伤肝细胞后，促进肝细胞内酶的释放，模型组的ALT，AST水平较正常组明显升高，YLS在（0.125～1）mg/ml剂量范围内，能显著抑制H2O2损伤肝细胞后ALT，AST水平的上升，并呈明显的剂量依赖性；VitE也能明显抑制H2O2损伤肝细胞后ALT，AST水平的上升。
       3.2   YLS对H2O2损伤肝细胞MDA和GSH的影响  H2O2损伤肝细胞后，肝细胞中的MDA明显升高，GSH则显著降低，除YLS0.125 mg/ml外，其余YLS各剂量组均能显著提高H2O2损伤肝细胞中的GSH含量和降低H2O2损伤肝细胞中的MDA含量，并呈明显的剂量依赖性；VitE对H2O2损伤肝细胞也具有提高GSH含量和降低MDA含量的作用。
       3.3   YLS对H2O2损伤肝细胞活性的影响  MTT法测定结果表明，H2O2损伤后模型组细胞活性明显下降，YLS在（0.125～1）mg/ml剂量范围内，能显著恢复和升高H2O2损伤肝细胞后的细胞活性，并呈明显的剂量依赖性；VitE也能恢复和升高H2O2损伤肝细胞后的细胞活性。
       表1  YLS对H2O2诱导肝细胞损伤的作用（略）
       与H2O2组比较， *P<0.05，**P<0.01，与对照组比较，ΔP<0.05，ΔΔP<0.01；n=6
       4  讨论
          
       在肝细胞损伤过程中,氧自由基（oxygen free radical，OFR）起了重要作用。OFR及其诱发的脂质过氧化物(LPO)可引起激烈的链式反应，产生几十种毒性分子，再次诱发成更多的OFR，继而加速加重肝细胞膜、细胞器、蛋白质以及DNA的损伤［7］。
       
       本实验应用H2O2诱导肝细胞损伤，H2O2可直接弥散入细胞内与各种细胞成分相互作用，且在富含铁的肝细胞内也转变为OH·， OH·等自由基可致DNA键断裂，并与细胞的重要成分起反应，亦可攻击膜磷脂中的多不饱和脂肪酸(PUFA)，引发膜脂质过氧化链式反应。双链脂肪酸过氧化(聚合)导致MDA形成增多，肝细胞膜通透性增加，使ALT与AST释放增加［8～11］。同时H2O2可促进GSH等抗氧化物消耗增多而水平下降，清除自由基功能也下降，损伤进一步加重。据此，本实验选择培养上清中ALT与AST，肝细胞MDA含量和GSH水平作为评价肝细胞损伤的指标。
       
       实验表明，H2O2损伤导致肝酶变化，如反映肝细胞损伤的AST，ALT均明显升高。在H2O2损伤的肝细胞中加入YLS后，随YLS剂量加大，细胞培养上清中的肝酶活性进行性降低，提示YLS能减轻肝细胞损伤，减少ALT与AST的释放。实验证明，在H2O2损伤的肝细胞中加入YLS后，YLS能降低肝细胞内的MDA含量，提示YLS能有效对抗H2O2引起脂质过氧化作用，减少脂质过氧化物的形成。研究显示，在H2O2损伤的肝细胞中加入YLS后，YLS能恢复肝细胞内的GSH含量，提示YLS能有效恢复抗氧化物水平和清除自由基功能。MTT比色法测定肝细胞存活率显示，在H2O2损伤的肝细胞中加入YLS后，YLS能恢复和提高H2O2损伤肝细胞后的细胞存活率。
       
       综上所述，研究表明YLS对H2O2损伤的肝细胞具有保护作用。其机制可能为YLS通过对抗H2O2引起的脂质过氧化作用，从而保护肝细胞膜和线粒体膜的完整性，使肝细胞免受H2O2产生的自由基引起的肝细胞损害。
       【参考文献】
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