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       【摘要】 
       目的研究葫芦钻提取物的抗肿瘤作用。方法体外抗肿瘤活性研究采用MTT比色法，靶细胞采用人肝癌细胞BLE7404；通过复制小鼠S180，H22腹水瘤和肉瘤动物模型，观察葫芦钻提取物对小鼠平均生命延长率和肿瘤抑制率的影响来评价体内抗肿瘤作用。结果葫芦钻水、醇提取物浓度为20 mg/ml时，对体外培养的肿瘤细胞的抑制率均＞50%；葫芦钻水、醇提取物的最大耐受剂量均是150 g/kg；经3次实验，葫芦钻水、醇提取物高、低剂量组对S180腹水瘤小鼠平均生命延长率均＞50%，葫芦钻醇提物高剂量组对H22腹水瘤小鼠平均生命延长率＞50%。葫芦钻水、醇提取物高、低剂量组对S180肉瘤小鼠平均瘤重抑制率均＞30%，对H22肉瘤小鼠平均瘤重抑制率均＞50%。结论 葫芦钻水、醇提取物具有一定的抗肿瘤作用。
       【关键词】  葫芦钻； 抗肿瘤
       基金项目：广西自然科学基金课题（桂科自0229016）
        
       Experimental Study on Antitumor Activity of Extracted Substances from Yao Herb Huluzuan
       
       HUANG Linyun,YU Shengmin ,ZHONG Ming, PAN Lili,NONG Chaozan,CHEN Shaofeng,YANG Zengyan
       (Guangxi Medical Institute for Nationality,  Nanning 530001, China; Guangxi Hospital for Nationality, Nanning 530001, China)
       Abstract:ObjectiveTo investigate the antitumor activity of Yao Herb--Huluzuan. MethodsThe antitumor activity in vitro against human cancer cell lines-- hepatocarcinoma BEL-7404 was determined by MTT method. The antitumor activity in vivo was evaluated by the prolongation ratios of life-span and the inhibition ratios of the tumor weight of transplanted mouse S180、H22 solid and ascites carcinoma model fed on extracted substances from Huluzuan. ResultsWhen the dose of water, alcohol extracted substances from Huluzuan was 20mg/ml, the inhibition ratios of the tumor cell in vitro was in excess of 50%. Both maximum tolerated dose of water, alcohol extracted substances from Huluzuan were 150 g/kg. In three times of the experiment, prolongation ratios of lifespan at high and low dose of water, alcohol extracted substances exceed 50%on mice S180 ascites carcinoma model in average, and at high dose of alcohol extracted substances exceeded 50%on mice H22 ascites carcinoma model in average, inhibition ratios at high and low dose of water、alcohol extracted substances exceed 30%on mice S180 solid carcinoma model and exceed 50%on mice H22 solid carcinoma model in average. ConclusionWater, alcohol extracted substances from Huluzuan has antitumor activity to some extent.
       Key words:Huluzuan；  Antitumor
       
       葫芦钻为天南星科植物石柑子Pothos chinensis (Raf.) Merr.的全草，为广西瑶医老班药“五虎、九牛、十八钻、七十二风”之一，瑶族传统治癌“打药”［1］，具有理气止痛，清热解毒的功效。根据民间用药经验，开展抗肿瘤作用实验研究，作者通过体内药效实验和体外药效实验评价葫芦钻提取物的抗肿瘤效果。
       1  材料
       1.1  药材  葫芦钻采自广西金秀瑶族自治县，经广西民族医药研究所戴斌主任药师鉴定为天南星科植物石柑子。
       1.2  动物  昆明种小鼠，体重18～22 g，雌雄兼用，SPF级，购自广西医科大学实验动物中心（生产许可证号：SCXK桂20030003），动物分组分笼饲养，自由饮水，喂全价颗粒饲料，动物室温度（24±2）℃，相对湿度50%～60%。
       1.3   主要药品与试剂  RPMI1640培养基为Gibco公司的产品；MTT为Sigma公司的产品；小牛血清为杭州四季清公司的产品；DMSO（二甲基亚砜）为Sigma公司的产品；其余试剂均为分析纯。
       1.4  细胞系  人肝癌细胞BEL7404引自中国科学院上海细胞生物研究所细胞库；用RPMI1640培养液（含10%的小牛血清，100 ku·L-1青霉素，100 mg·L-1链霉素）37℃，5%CO2，相对湿度100%培养，0.25%胰蛋白酶消化传代。
       1.5  瘤株  小鼠S180，H22腹水瘤株和小鼠S180，H22肉瘤株均由广西中医药研究所引进，本实验室冷冻保存，用昆明种小鼠接种传代。
       2  方法
       2.1  葫芦钻提取物的制备  葫芦钻水提物：取药材加10倍量水水煎两次，1 h/次，滤液合并浓缩，4℃冰箱保存备用；葫芦钻醇提物：取粗粉加5倍量95%乙醇回流提取3次，第1次2 h，第2，3次各1 h，合并滤液减压回收乙醇至无醇味，浓缩，4℃冰箱保存备用。
       2.2   体外药效实验  MTT法测定：BEL7404经胰蛋白酶处理制成单细胞悬液，接种96孔板，每孔接种3 000个细胞/100 μl，含10%FBS的RPMI1640培养液，培养24 h后，实验组分别加入最终浓度为1，5，10，20 mg/ml葫芦钻水提物和醇提物的培养液，对照组则加入等体积溶剂的培养液。每组均设7个平行孔。置37℃，5%CO2培养箱培养5 d后，加入MTT 20 μl，4 h后弃上清，每孔加入DMSO 100 μl，1 h内在BioRad550 Micoplate Reader 上用波长546 nm比色，测定OD值，按下式计算药物对肿瘤细胞生长的抑制率［2］。
       
       肿瘤细胞生长抑制率(%)=（1实验组平均OD值/对照组平均OD值）×100%
       2.3  急性毒性实验   在预试验基础上， 取40只昆明种小鼠，体重18～22 g，雌雄各半，随机分为两组。以动物能耐受的最大浓度，最大容积的剂量，灌胃给药，葫芦钻水提物3.75 g生药/ml，葫芦钻醇提物3.75 g生药/ml，0.4 ml/10 g体重。给药后连续观察7 d，逐日观察记录动物反应情况［3］。
       2.4   体内药效实验［4］
       2.4.1  对S180，H22腹水瘤小鼠生存天数的影响在无菌条件下，抽取小鼠腹腔内连续传代的S180，H22细胞，从右下腹部注入受体动物腹腔内，每鼠0.2 ml。接种24 h后随机分组，每组10只。接种次日葫芦钻水提物高、低剂量组（37.5，12.5 g/kg），葫芦钻醇提物高、低剂量组（37.5，12.5 g/kg），模型对照组（蒸馏水），连续ig给药10 d后，停止给药，正常饲养，直到自然死亡，逐日记录荷瘤小鼠的存活状况，按下式计算各组平均生命延长率。
       
       生命延长率= 治疗组平均存活天数-对照组平均存活天数对照组平均存活天数×100%                            
       
       上述实验均重复3次，并计算3次的平均值。
       2.4.2  对S180，H22肉瘤小鼠的抑瘤作用分别选择接种7 d后的S180，H22肉瘤（腹水型）小鼠，颈椎脱臼致死，固定于板上，消毒腹部皮肤，用无菌空针抽吸含瘤细胞腹水，接种于受体动物右前肢腋部皮下，每鼠0.2 ml。24 h后将已接种的小鼠随机分为对照组、治疗组（高，低剂量组），每组10只。治疗组每天ig给药1次，连续10 d，对照组ig等量的蒸馏水。于停药后第2天处死，称体重和瘤重，按下式计算抑瘤率。
       
       肿瘤抑制率= 对照组瘤重－给药组瘤重对照组瘤重×100%
       
       上述实验均重复3次，并计算3次的平均值。
       2.5  统计学处理    应用t检验进行统计学分析，数据以±s表示。
       3  结果
       3.1   MTT法    不同浓度葫芦钻水、醇提取物对人肝癌细胞株BEL7404的抑制。结果见表1。
       表1  不同浓度葫芦钻水、醇提取物对体外培养的人肝癌细胞BEL7404的影响（略）
       结果显示，葫芦钻水、醇提取物对体外培养的人肝癌细胞BEL7404增殖都表现较强的抑制作用，抑制率与提取物浓度正相关。当葫芦钻水、醇提取物浓度为20 mg/ml时，抑制率均＞50%，且葫芦钻醇提取物作用效果强于葫芦钻水提物。
       3.2  葫芦钻水提物日总剂量为150 g/kg，葫芦钻醇提物日总剂量为150 g/kg，给药当天动物出现便溏现象，其后观察7 d，对小鼠体重、行为、进食、皮毛、眼和黏膜、呼吸、四肢活动均无任何影响。说明葫芦钻水、醇提取物的急性毒性小。
       3.3  3次实验结果显示，葫芦钻水、醇提取物高、低剂量组对S180腹水瘤小鼠平均生命延长率均＞50%，葫芦钻醇提物高剂量组对H22腹水瘤小鼠平均生命延长率＞50%。结果见表2。
       表2  葫芦钻提取物对S180和H22腹水瘤小鼠存活期的影响（略）
       与模型组比较，※P<0.05，※※P<0.01；n=10
       3.4  3次实验结果显示，葫芦钻水、醇提取物高、低剂量组对S180肉瘤小鼠平均瘤重抑制率均＞30%，对H22肉瘤小鼠平均瘤重抑制率均＞50%，结果见表3 。
       表3  葫芦钻提取物对S180和H22肉瘤小鼠的抑制作用（略）
       与模型组比较 ※P<0.05 ※※P<0.01;n=10
       
       4  讨论
       
       寻找具有抗癌作用强，抗癌谱广，副作用小的天然活性化合物是抗癌药物研究的重要途径。近年来对传统瑶药开展抗肿瘤作用的筛选研究，发现瑶药葫芦钻具有一定的抗肿瘤作用。本研究结果显示，通过MTT法检测葫芦钻水、醇提取物对人肝癌细胞生长有抑制作用。当药物浓度低于5 mg/ml时，对肿瘤细胞的抑制作用不明显。随着药物浓度升高至20 mg/ml，药物对肿瘤细胞生长的抑制较明显，抑制率在50%以上。且葫芦钻醇提物的作用效果强于水提物。急性毒性实验中，葫芦钻水、醇提取物的最大耐受剂量均是150 g/kg，急性毒性较小。从实验结果可以看出，葫芦钻水、醇提取物在改善S180腹水瘤小鼠存活率方面作用非常明显，生命延长率为73.65%～97.43%，与模型组比较，平均生存期延后10 d以上。葫芦钻醇提物高剂量组在改善H22腹水瘤小鼠存活率方面作用明显，生命延长率为54.75%。葫芦钻水、醇提取物对S180肉瘤和H22肉瘤均具有明显的抑制作用，对S180肉瘤平均抑制率＞30%，对H22肉瘤平均抑制率＞50%，与模型组比较有显著性差异（P<0.01）。这些说明葫芦钻提取物具有较强的体内和体外抗肿瘤作用，有进一步研究的价值。本研究结果为葫芦钻的临床抗肿瘤应用及抗肿瘤活性成分的进一步分离筛选提供了依据和资料。
       【参考文献】
         　　［1］ 戴 斌，丘翠嫦，李钊东，等．瑶医用药品种调查报告［J］.中草药，1997，28（12）：746.
       
       ［2］ 张均田．现代药理实验方法（上册）［M］．北京：北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，1998：819.
       
       ［3］ 中华人民共和国卫生部药政管理局．中药新药研究指南（药学，药理学，毒理学）［M］．1994：203．
       
       ［4］ 徐叔云，卞如濂，陈 修．药理实验方法学［M］.北京：人民卫生出版社，2002：1757.