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       【摘要】 
       目的建立反相高效液相色谱法同时测定宁夏枸杞中芦丁和绿原酸含量的方法。方法色谱分析条件 Shim-pack VPODS 色谱柱（250 mm×4. 6 mm，5 μm），以乙腈水乙酸（5∶94.5∶0.5）为流动相A，乙腈∶水∶乙酸（70∶29.5∶0.5）为流动相B，采用梯度洗脱，流速0.5 ml·min-1，检测波长342 nm，柱温30℃。结果绿原酸和芦丁线性范围均为10～100 μg·ml-1（相关系数分别为r＝0.999 5和r=0.999 8），平均回收率（n＝5）分别为98.6%，99.0%；不同产地、不同年份宁夏枸杞样品中芦丁和绿原酸含量存在差异。结论该方法重现性好，适用于同时测定枸杞中芦丁和绿原酸的含量。
       【关键词】  宁夏枸杞； 黄酮类化合物； 高效液相色谱法； 芦丁； 绿原酸
       基金项目：教育部科学技术项目（204148）、宁夏大学自然科学基金项目及宁夏国际合作重大项目
       Determination of Chlorogenic Acid and Rutin in Lycium barbarum L.  from Different Habitats by HPLC
       ZHANG Ziping,  LIAO Guoling,SHI Xiaowen
       （Key Laboratory of Ministry of Education for Protection and Utilization of Special  Biological Resources in Western China, Ningxia University，Yinchuan  750021, China; Pharmacology and Medical Exam Dept of Ningxia Medical College, Yinchuan 750021,China）
       Abstract：ObjectiveTo develop an RPHPLC method with gradient dilution for simultaneous determination of chlorogenic acid and rutin in Lycium barbarum L. from different habitats.MethodsThe separation was performed on a Shim-pack VPODS 250 mm×4.6 mm （5 μm）, acetonitrile/water/acetic acid（5∶94.5∶0.5）was used as the mobile phase A and acetonitrile/water/acetic acid（70∶29.5∶0.5）as the mobile phase B with gradient elution, the flow rate was 0.5ml·min-1，the detection wavelength was at 342 nm and the temperature was 30℃. ResultsThe good linearities of chlorogenic acid and rutin were obtained over the ranges of 10～100 μg·ml-1(r＝0.999 5 and r＝0.999 8 respectively), the average recoveries were 98.6% and 99.0% respectively（n＝5）. The contents of chlorogenic acid and rutin in Lycium barbarum L. from different habitats were different.ConclusionThe method is rapid and reproducible，the method can be used to determine chlorogenic acid and rutin in  Lycium barbarum L. from different habitats.
       Key words：Lycium barbarum L.;  Flavonoids;  HPLC;  Rutin;  Chlorogenic acid  
       
       宁夏枸杞Lycium barbarum L.是我国传统名贵药材，具有增强免疫力、抗氧化、抗肿瘤等多方面的药理作用［1］。黄酮类化合物是其有效成分之一，具有明显的抗氧化作用［2，3］。张颖等［4］采用分光光度法测定了不同产地宁夏枸杞总黄酮含量，钱建亚等［5］报道北方枸杞Lycium chinese Mill中含有芦丁和绿原酸等黄酮类化合物，但宁夏枸杞中绿原酸和芦丁含量的测定尚未见报道。本研究建立了反相高效液相色谱法同时测定宁夏枸杞中芦丁和绿原酸含量的方法，并用建立的分析方法，测定了不同产地、不同年份的宁夏枸杞中芦丁和绿原酸的含量，为建立宁夏枸杞质量标准提供理论依据。
       1  器材
       
       仪器：CBM20A高效液相色谱仪（日本岛津公司），SPD20A检测器，二元梯度泵， LCSolution色谱工作站，MilliQ A10型纯水仪（MILLIPORE），KQ500B型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。 主要试剂：甲醇、乙腈为色谱纯，其它为分析纯。绿原酸、芦丁对照品购自中国药品生物制品检定所。
       
       本研究选择宁夏枸杞 “宁杞Ⅰ号”2004，2005年夏季盛果期果实为材料，为尽可能减小田间管理水平对枸杞品质的影响，在采样时尽量选择枸杞树龄、植株密度、水肥条件、枝条修剪水平和成熟度一致的样品，所有枸杞样品均由宁夏农科院枸杞研究所鉴定，枸杞样品来源见表1。
       2  方法与结果
       2.1  色谱分析条件通过对色谱柱、波长、流动相、流速、洗脱方式的选择及优化确定了枸杞黄酮类化合物的色谱分析条件。色谱柱：岛津VPODS 250 mm×4.6 mm （5 μm）；流动相A∶乙腈∶水∶乙酸（5∶94.5∶0.5）；流动相B：乙腈：水∶乙酸（70∶29.5∶0.5）；梯度洗脱；流速0.5 ml·min-1；检测波长342 nm；柱温30℃；进样量5 μl。
       2.2  供试品制备精密称取过16目筛的枸杞样品2.000 g，石油醚回流脱脂，在脱脂后的残渣中加入80%乙醇30 ml，60℃超声提取两次，30 min/次，过滤合并滤液，40℃减压浓缩。浓缩液经HPD600型大孔树脂，蒸馏水洗脱除去水溶性杂质后，再用50%乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液50 ml为供试品溶液。色谱分析时，供试品溶液过0.45 μm有机系微孔滤膜。
       2.3  对照品溶液制备精密称取绿原酸、芦丁对照品2.50 mg于25 ml容量瓶中，少量甲醇溶解，50%乙醇定容，分别制成100 μg·ml-1的绿原酸、芦丁对照品贮备溶液。
       2.4  标准曲线绘制  分别精密量取100 μg·ml-1的绿原酸、芦丁对照品贮备液1.0，2.0，4.0，8.0 ml置于10 ml容量瓶中，50%乙醇定容，制成10，20，40，80和100 μg·ml-1的绿原酸、芦丁标准溶液。色谱分析时，对照品溶液过0.45 μm有机系微孔滤膜。各吸取5 μl进样，按2.1项所述色谱条件进行色谱分析。以质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线并进行回归计算，得绿原酸回归方程Y=9 144.7X-25 531.9,r=0.999 5。芦丁回归方程Y=5 333.9X-3407.8，r=0.999 8。表明绿原酸和芦丁在10～100 μg/ml范围内线性良好。
       2.5  精密度实验   取1﹟样品的供试品溶液，连续进样5次，按2.1项所述色谱条件进行色谱分析，记录色谱图。芦丁峰面积RSD为0.53%，绿原酸峰面积RSD为1.50%，表明仪器精密度良好。
       2.6  稳定性实验  取1﹟样品的供试品溶液，分别在0，2，4，8，12 h，按2.1所述色谱条件进行色谱分析，记录色谱图。芦丁峰面积RSD为1.97%，绿原酸峰面积RSD为1.96%，表明供试品在12 h内稳定。
       2.7  重现性实验  分别制备5份1﹟样品的供试品溶液，按2.1项所述色谱条件进行色谱分析，记录色谱图。芦丁峰面积RSD2.70%，绿原酸峰面积RSD为2.53%，表明方法重现性良好。
       2.8   回收率实验   精密称取已知含量的样品，加芦丁、绿原酸对照品适量，按2.2项供试品溶液的制备方法操作，按2.1项所述色谱条件进行色谱分析，测定平均回收率分别为99.0%，98.6%，RSD分别为1.02%，1.14%。
       2.9  样品含量测定 取15个宁夏枸杞“宁杞Ⅰ号”样品，按2.2项所述制备各样品的供试品溶液，2.1项色谱分析条件进行色谱分析，色谱图见图1。根据对照品回归方程计算枸杞样品中芦丁、绿原酸含量，结果见表1。
       图1  7# 样品色谱图（略）
       3  结果
       3.1  检测波长的选择  取供试品溶液，200～700 nm波长扫描，经筛选后比较样品在256，286，320，342，370 nm的HPLC图谱，发现342 nm处色谱峰分离情况良好，各组分均有较大吸收，故选定342 nm为色谱分析的检测波长。
       3.2  流动相及洗脱方式的选择  以甲醇-0.4%磷酸、乙腈-乙酸体系为流动相进行梯度洗脱实验，结果表明流动相A∶乙腈∶水∶乙酸（5∶94.5∶0.5）；流动相B∶乙腈∶水∶乙酸（70∶29.5∶0.5）；洗脱梯度为0～14 min，100%～86%A；14～22 min，86%～84%A；22～40 min，84%～70%A； 40～55 min，70%～100%A，分离效果较好。
       表1  不同产地枸杞样品中芦丁和绿原酸含量（略）
       4  讨论
       
       我们测定了7个不同产地2004，2005年的“宁杞Ⅰ号”枸杞样品中芦丁和绿原酸含量。不同产地2005年枸杞样品的芦丁含量明显高于2004年；绿原酸含量变化不大，2005年略高于2004年。说明随着保存时间的延长，枸杞黄酮类化合物中芦丁的损失大于绿原酸。分析7个不同产地样品中芦丁和绿原酸含量以及相应的色谱图，表明不同产地的“宁杞Ⅰ号”枸杞中黄酮类化合物含量存在明显差异。但仅依据某些化学成分的含量差异，来评价宁夏枸杞的品质好坏是不全面的，还有待于通过指纹图谱和药效方面的研究，才能对宁夏枸杞的品质进行客观、科学地评价。
       
       通过实验建立了反相高效液相色谱法同时测定宁夏枸杞中芦丁和绿原酸含量的方法。该方法简便、重现性好，可以同时测定枸杞中绿原酸和芦丁的含量，为进一步研究宁夏枸杞黄酮类化合物色谱指纹图谱奠定了基础。
       【参考文献】
         　　［1］ 白寿宁.宁夏枸杞研究［M］.银川：宁夏人民出版社,1998：681.
       
       ［2］ 黄元庆,谭安民,沈 泳，等.枸杞黄酮类化合物清除氧自由基及对小鼠L1210癌细胞能量代谢的抑制作用［J］.卫生研究,1998,27(2):109.
       
       ［3］ 黄元庆,鲁建华,沈 泳，等.枸杞总黄酮类化合物抗脂质过氧化研究［J］.卫生研究，1999,28(2)：115.
       
       ［4］ 张 颖,张立睦,周红英，等.不同产地枸杞子中黄酮含量的测定［J］.中国中医药科技,2004,11(2)：102.
       
       ［5］ Jian-Ya Qian, Dong Liu, A-Gen Huang. The efficiency of flavonoids in polar extracts of Lycium Chinese Mill fruit as free radical scavenger［J］.Food Chemistry, 2004, 87：283.