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       【摘要】 
       目的通过考察3个品种芒果叶不同组织部位甲醇提取物的高效液相色谱(HPLC)指纹图谱，并对其HPLC指纹图谱进行比较，为研究和测定芒果叶等叶类药材的HPLC指纹图谱提供方法指导和实验依据。方法Waters symmetry C18(5 μm，4.6 mm×250 mm)色谱柱；乙腈∶0.1%磷酸为流动相，梯度洗脱；流速：1.0 ml/min；柱温：25℃；检测波长：216 nm。结果芒果叶不同组织部位的HPLC指纹图谱有明显的差异。结论在研究测定芒果叶等叶类药材指纹图谱时必须注意取样的均匀性。
       【关键词】  芒果叶； 指纹图谱； 梯度洗脱； 高效液相色谱
       基金项目：国家科技部重大项目资助（2004BA901A09）；广西科技厅重点资助项目（桂科能0443001-18）
       
       Comparison of HPLC Fingerprint Photometry among  Different Tissues of Mangifera indica L.
       FENG Xu, DENG Jiagang, QIN Jieping*, WANG Xinhua, ZHANG Wei
       (Guangxi College of Traditional Chinese Medicine, Nanning 530001, China)
       Abstract：ObjectiveTo study HPLC Fingerprint of methanol extract from different tissues from Mangifera indica L. in various species and make a comparison among them. So to provide method guideline and experimental basis for studying and establishment of  HPLC Fingerprint photometry of Caulis Herbs like leaves of Mangifera indica L.. MethodsWaters symmetry C18 (5 μm，4.6 mm×250 mm) column was applied with 0.1% phosphoric acid as mobile phase in a gradient mode. The flow rate was 1.0 ml/min, the temperature of column was 25℃, and the wave-length of detection was 216 nm. ResultsThe HPLC Fingerprint photometry of Mangifera indica L. in different tissues showed great difference. ConclusionThe Homogeneity should be taken into consideration when study the Fingerprint photometry of Caulis Herbs.
       Key words：Mangifera indica L.；  Fingerprint photometry；  Gradient elution；  HPLC
       
       芒果叶系漆树科植物芒果Mangifera indica L. 的干燥叶，性味酸、甘、凉、平，具有行气疏滞，祛疳积的功能，用于热滞腹痛，气胀，小儿疳积，消渴等证［1］，民间用于治疗咳嗽，临床证明对支气管炎所致咳嗽、咯痰有效，并有一定的平喘作用［2］。芒果叶含抗坏血酸、鞣质、芒果苷及鞣花酸、α儿茶精、莽草精、奎尼酸、山柰醇、ια侧柏烯等多种成分［3］，其中芒果苷是芒果叶的主要有效成分。芒果苷(mangiferin)是一种四羟基吡酮的碳糖苷，属双苯吡酮类化合物，研究表明，芒果苷是芒果叶止咳、化痰的主要活性成分［4］。芒果叶为广西地方习用药材，收载于《广西中药材标准》1990年版［1］，标准中只建立了“性状”项，尚未建立鉴别、含量测定和指纹图谱标准。曾有文献报道有关芒果苷的含量测定方法［5］，但关于芒果叶的指纹图谱尚未见报道。在研究建立不同产地、不同品种芒果叶指纹图谱的工作中，笔者发现如果取样不够规范，会使测得的指纹图谱产生较大的差异。为此，考察了芒果叶不同组织甲醇提取物的HPLC指纹图谱的差异，为研究和测定芒果叶等叶类药材的HPLC指纹图谱提供方法指导和实验依据。本实验应用反相高效液相色谱法测定了3 个不同品种的芒果叶样品不同组织部位的HPLC指纹图谱，并对其指纹图谱进行了比较，结果显示3个品种的芒果叶不同组织部位的HPLC指纹图谱相差很大，提示在研究测定芒果叶等叶类药材指纹图谱时必须注意取样的规范和均匀性。
       1  仪器与试药
       1.1  仪器美国Agilent 1100 Series高效液相色谱仪；Millipore Simplicity-185超纯水器（美国密里博公司）；BP211D 电子分析天平（德国赛多利斯）；SB3200-T超声清洗仪(功率：250W，频率：50KHz)(必能信超声(上海)有限公司)。
       1.2  试药乙腈：一级色谱纯(天津四友生物医学技术有限公司)；水为高纯水；其余试剂均为分析纯；芒果苷标准对照品（中国药品生物制品检定所提供，供含量测定用，批号：111607-200301）；芒果叶样品均采自广西亚热带作物研究所芒果园，经广西亚热带作物研究所黄国第工程师鉴定分别为漆树科植物芒果Mangifera indica L.的3个栽培品种“红象牙芒”“台农一号芒”“桂热芒82号”的叶。
       2  方法
       2.1  流动相及梯度洗脱条件的选择比较了甲醇-水、乙腈-水系统，发现乙腈-水系统分离效果较好，且柱压较甲醇-水系统低，考虑到芒果叶甲醇提取物含有部分酸性成分，在流动相中加入磷酸可以有效改善图谱中极性较大成分的峰形和分离度。此外，由于芒果叶甲醇提取物所含化学成分复杂，等度洗脱很难在较短的时间内实现各化学成分的分离，采用梯度洗脱可以兼顾强极性和相对弱极性成分的分析，得到的色谱图信息量丰富，各成分色谱峰峰形尖锐对称，且分离度较好，因此，最后确定用乙腈0.1%磷酸水溶液作为流动相，进行梯度洗脱。样品色谱图见图2。
       2.2  检测波长的选择比较芒果叶甲醇提取物从190～400 nm检测波长的色谱图，并依据DAD二极管阵列检测器检测的三维图谱，检测波长为216 nm时，可将全谱物质检测到，能体现色谱图整体特征，故选择216 nm作为检测波长。
       2.3  色谱条件色谱柱为Waters symmetry C18柱(5 μm，4.6 mm×250 mm)；检测波长：216 nm；体积流量：1.0 ml/min；柱温：25℃；流动相：A相为0.1%（V/V）磷酸水溶液，B相为乙腈，梯度洗脱。
       2.4  对照品溶液的制备精密称取芒果苷对照品2.03 mg，置10 ml容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，即得芒果苷对照品溶液。
       2.5  供试品溶液的制备将各品种的芒果叶于50℃烘干，分离叶肉及叶脉，叶肉和叶脉分别用粉碎机粉碎成粗粉，取样品粗粉约0.12 g，精密称定，精密加入甲醇20 ml，称定重量，超声提取40 min，放冷置至室温，用甲醇补足减失的重量，摇匀，0.45 μm滤膜滤过，即得。
       2.6  参照色谱峰的确定在“2.3”色谱条件下，取芒果苷对照品溶液进样，得到芒果苷对照品的色谱图（见图1），由于在各个芒果叶样品图谱中均出现保留时间、紫外光谱与芒果苷对照品一致的色谱峰（6号峰），并且该峰与相邻峰分离良好，保留时间适中（20.609 min），经对照实验，确定其为芒果苷的色谱峰，因此本实验选择芒果苷色谱峰（S）作为参照峰，用以计算各峰的相对保留时间和相对峰面积比值。
       图1  芒果苷对照品色谱图（略）
       图2  芒果叶药材HPLC色谱图（略）
       3  结果
       3.1  方法学考察
       3.1.1  精密度试验取同一芒果叶供试品溶液，连续进样5次，考察仪器的精密度。结果表明，主要共有峰1～7号峰相对保留时间的RSD为0.03～0.14%，相对峰面积的RSD为0.31%～1.84%，说明仪器精密度良好。
       3.1.2  稳定性试验取同一芒果叶供试品溶液,在0，2，6，12，24 h连续进样5次，检测色谱图，测定主要共有峰的相对保留时间和相对峰面积，结果主要共有峰1～7号峰相对保留时间的RSD为0.07%～0.38％，相对峰面积的RSD为0.60%～2.56％，结果表明：供试品溶液常温下0～24 h之间可保持稳定,并且仪器精密度和稳定性很好。
       3.1.3  重现性试验 取同一批号的芒果叶样品5份，分别按供试品溶液制备方法制备供试品溶液,并分别测定其色谱图，结果其相对保留时间稳定，主要共有峰1～7号峰相对保留时间的RSD为0.05%～0.12％，相对峰面积的RSD为1.88%～2.20％，符合指纹图谱要求(RSD≤3％)。说明本方法重现性较好。
       3.2  样品测定分别取不同品种芒果叶叶肉和叶脉，按“2.5”项制成供试品溶液，精密吸取各供试品溶液10 μl，注入液相色谱仪，在相同色谱条件下采集60 min色谱图。色谱图见图3～8。
       3.3  结果分析
       3.3.1  由于各样品HPLC图谱中单峰面积大于总峰面积10%的色谱峰数目只有1～3个，为了能有较多的信息说明实验结果，本实验对大于总峰面积1%的峰都进行了分析说明，测得的样品HPLC指纹图谱共有6张，发现有7个共有色谱峰，各样品HPLC指纹图谱共有峰的相对保留时间见表1。每个样品的指纹图谱均可分为3个部分：（1）保留时间0～5 min，有3个共有峰及一些不能分离的小杂峰；（2）保留时间5～30 min，为特征峰区，有3个共有峰，各个样品特征峰数目、峰面积及保留时间均存在较大差异；（3）保留时间30～60 min，有1个共有峰，且峰强度很强，其余部分为不能分离的小杂蜂，但从其整体上看有较强的特征性。
       表1  6份芒果叶样品HPLC指纹图谱的各主要共有峰的相对保留时间（略）
       3.3.2  红象牙叶肉与叶脉的HPLC指纹图谱比较 从图可知，两者HPLC指纹图谱差异明显，见图3～4，两者在峰数目、峰形及各主要共有峰峰面积比值（见表2）差别显著。经对比发现，叶肉的4号峰，H1，H2，H3峰强度明显比叶脉强，叶脉的1，2，7，H4，H5号峰强度明显比叶肉强，H4为红象牙叶脉的特有峰。
       表2  红象牙叶肉与叶脉HPLC指纹图谱各主要共有峰相对峰面积（略）
       图3   红象牙叶肉HPLC指纹图谱（略）
       图4  红象牙叶脉HPLC指纹图谱（略）
       3.3.3  桂热芒82号叶肉与叶脉的HPLC指纹图谱比较两者HPLC指纹图谱如图5～6，差异很明显，峰数目、峰形及各共有峰峰面积比值（见表3）差别都很大，叶肉的4，G1，G2，G3，G4峰明显比叶脉强，叶脉的1，2，3，5，7，G5号峰明显比叶肉强，G5为桂热82号叶脉的特有峰。
       图5  桂热芒82号叶肉HPLC指纹图谱（略）
       3.3.4  台农一号叶肉与叶脉的HPLC指纹图谱比较 两者HPLC指纹图谱如图7～8，差异很明显，峰数目、峰形及各共有峰峰面积比值（见表4）差别也很大，叶肉的4，T1，T2，T3，T4，T5峰明显比叶脉强，叶脉的1，3，5，7号峰明显比叶肉强，T3为台农一号叶肉的特有峰。
       图6  桂热芒82号叶脉HPLC指纹图谱（略）
       表3  桂热芒82号叶肉与叶脉HPLC指纹图谱各共有峰相对峰面积（略）
       图7  台农一号叶肉HPLC指纹图谱（略）
       图8  台农一号叶脉HPLC指纹图谱（略）
       4  讨论
          
       通过3个品种芒果叶叶肉和叶脉的HPLC指纹图谱比较，发现3个品种的叶肉和叶脉图谱差异显著，同一品种的不同组织部位HPLC指纹图谱均出现其特有的色谱峰，如图4红象牙叶脉的特有峰H4峰，图6桂热82号叶脉的特有峰G5峰，图7台农一号叶肉的特有峰T3峰，说明3个不同品种的芒果叶叶肉和叶脉中所含的化学成分的种类及含量是不同的，其中红象牙叶脉的芒果苷含量比叶肉高，而另两个品种中叶肉的芒果苷含量比叶脉高，3个品种叶肉的4号峰均比叶脉强，1，2，3，5，7号峰均比叶脉弱，其中4、7号峰最为明显。实验结果表明全叶粉碎后取样的均匀程度对指纹图谱的研究测定影响很大，取样不均匀直接影响峰的大小，甚至使某些峰消失，间接导致指纹图谱研究结果产生较大的偏差，所以在研究建立如芒果叶等叶类药材的中药指纹图谱时必须考虑取样的影响因素，取样均匀是保证指纹图谱一致性的前提。
       表4  台农一号叶肉与叶脉HPLC指纹图谱各共有峰相对峰面积（略）
       按照“中药注射剂指纹图谱实验研究技术指南”中药材的取样要求，供试品取样应注意代表性，以保持实验室取样与实际生产应用药材一致，例如地上部分的药材，取样约0.5～1 kg，必要时应做比较试验，以考察所含成分有无显著差异，供生产参考。此外，称样应按照常规要求，将选取的供试品适当粉碎后混合均匀，再从中称取试验所需的数量，一般称取供试品与选取样品的比例为1∶10，因为指纹图谱需要提供量化的信息，称取供试品的精度一般要求取3位有效数字。经考察，将芒果叶药材干燥后粉碎过25目筛，即可达到使样品均匀的目的，经重复性实验考察，各主要峰峰面积的RSD均在1.86%～2.20％之间。
       【参考文献】
         　　［1］ 广西壮族自治区卫生厅.广西中药材标准［M］.南宁：广西科学技术出版社，1992：54，207.
       
       ［2］ 陆存蕴.治疗慢性支气管炎药物芒果苷鉴定会报道［J］.医药工业，1976，1：51.
       
       ［3］ 《全国中草药汇编》编写组.全国中草药汇编(下册)［M］.北京：人民卫生出版社，1983：306.
       
       ［4］ 邓家刚，郑作文，曾春晖.芒果苷的药效学实验研究［J］.中医药学刊，2002，7(12)：37.
       
       ［5］ 刘华钢，黄海滨，陈燕军.HPLC法测定芒果止咳片中芒果苷的含量［J］.中成药，1997，19(10)：14.