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       【摘要】 
       目的探讨中药瑞香狼毒水提取物对肺癌细胞超微结构的影响。方法用瑞香狼毒水提取物处理两个肺癌细胞株(人小细胞肺癌NCIH446和人非小细胞肺腺癌NCI-H157)。用药前后分别取材，按悬浮细胞操作规程常规制备超薄切片，透射电镜观察用药前后两肺癌细胞株超微结构的变化。结果用药后较用药前两肺癌细胞株的超微结构变化主要表现在：①细胞形态的改变：多数细胞体积变小,形态不规则,胞质电子密度增高。少数细胞体积增大，表面胞膜突起消失，部分细胞膜呈线性中断。②细胞器的改变：细胞器减少或变形、结构不清。个别细胞线粒体呈气球样肿胀，嵴减少或消失。③细胞核的改变：细胞核内染色质边集，基质电子密度增高。有些细胞核内异染色质分界不清，核仁呈均一电子密度，网状结构消失。结论 中药瑞香狼毒水提取物对肺癌细胞有明显的细胞毒作用。
       【关键词】  瑞香狼毒水提取物； 超微结构； 肺癌细胞株
       基金项目：河北省张家口市科技局资助项目(41129)
       The Effects of Aqueous Extract from Ruixianglangdu on Ultrastructure of Lung Carcinoma
       XING Liqiang, LI Wang,LI Hongjun, WANG Feng,SUN Li
       (Central Laboratory,Hebei North University, Zhangjiakou 075000,China; Charity Hospital of Zhangjiakou City, Zhangjiakou 075000,China )
       Abstract：ObjectiveTo study the effects of aqueous extract from Ruixianglangdu on ultrastructure of lung carcinoma. MethodsTwo lung carcinoma cell strains were treated with aqueous extract from Ruixianglangdu, the preparation of electric microscope(EM) samples were accomplished before and after being treated respectively. To compare the changes in ultrastructure of lung carcinoma between before and after being treated with aqueous extract from Ruixianglangdu . Results The changes of ultrastructure in lung carcinoma cell strains after being treated with extracts from Ruixianglangdu were shown:Firstly, in majority the size of lung carcinoma cells were contractible,and with irregular cellular morphous,the electron density of cytoplasm increased. In few of the lung carcinoma cells were swelling, the protuberance on cellular surface disappeared, in few of its,the cellular membrane were broken.Secondly, the cellular organelle of lung carcinoma cells decreased or deformation and unclear in structure.The mitochondria balloon swell,the mitochondrial cristae decreased or disappeared.Thirdly,The nuclear chromatin of lung carcinoma cells concentrate to periphery, the electron density of cytoplasm increased, in some cells,the heterochromatin of nucleus were blurry,and the nucleole became uniform in electron density, the formatio reticularis of nucleole disappeared.ConclusionThe extracts of Ruixianglangdu have obvious cytotoxicity to lung carcinoma cell strains.
       Key words：Aqueous extract of Ruixianglangdu;   Ultrastructure；  Lung carcinoma cell strains
       
       肺癌是危害人类生命健康最常见的恶性肿瘤之一，由于种种原因多数肺癌患者确诊时已到晚期。化疗是目前大多数肺癌患者的主要治疗手段，尽管新的抗癌药物及化疗方案不断推出，但治疗效果仍不尽人意。而肿瘤组织对化疗的耐药性是化疗失败的主要原因之一。因而,提高肿瘤组织对化疗的敏感性一直是肿瘤治疗研究的重要课题。本文用祖国医学中的瑞香狼毒水提物作用于肺癌细胞观察其对肺癌细胞超微结构的影响，从亚细胞水平探讨其杀伤肺癌细胞的机制，旨在为中西药结合治疗肺癌、提高药物敏感性及改善治疗效果提供依据。
       1  材料与方法
       1.1  中药提取瑞香狼毒采自河北北部，提取前经专家鉴定确认。将瑞香狼毒自然晾干取其根部粉碎，装入容器中加入适量蒸馏水浸泡30 min，加热提取。瑞香狼毒水提药物终浓度为5 ml/g生药。
       1.2  细胞培养
       1.2.1  两个肺癌细胞株人小细胞肺癌NCI-H446和人非小细胞肺腺癌NCI-H157购自中国协和医科大学基础医学院细胞中心。
       1.2.2   CO2细胞培养箱为美国THERMO 公司产品。
       1.3  超微结构观察
       1.3.1  透射式电子显微镜为日本电子公司JEM 100-CXII型产品。超薄切片机为瑞典NOVA-LKB型
       1.3.2   样品制备两肺癌细胞株复苏后在培养瓶中培养传代6瓶，至对数生长期。其中2瓶消化后留取电镜样品，另4瓶分实验组和对照组，实验组加28 μl瑞香狼毒水提物(前期实验已测得细胞24 h 50%凋亡率的用药量)，对照组加等量培养基。继续培养24 h后胰酶消化取电镜样品。
       1.3.3  超薄切片的制备将留取的电镜样品经2.5%戊二醛预固定0.5 h，将其与蛋清混匀后低速（1 000 r/min）离心5 min，戊二醛后固定2 h。细切成1 mm×1 mm×1 mm小块，PBS清洗5 min×3次。再经1%锇酸固定1.5 h后PBS清洗，5 min×3次。丙酮梯度脱水，环氧树酯EPON812包埋，超薄切片，铀-铅染色，电镜观察。
       2  结果
       2.1  人小细胞肺癌NCI-H446细胞株用药前：①细胞形态规则，圆形或椭圆形，胞膜完整可见少量微绒毛样突起；②胞核大，核仁突出，有时可见多个核仁，核染色质主要为异染色质。③胞质内粗面内质网和多聚核糖体发达，可见膜包分泌颗粒，散在或成簇分布，线粒体丰富，嵴多呈管泡状，溶酶体和高尔基体少见，有时可见到髓鞘样残余体。
       2.2  人非小细胞肺腺癌NCI-H157细胞株用药前：①细胞形态较规则，圆形或卵圆形，细胞表面可见少量突起，胞膜完整清晰；②核较大，不规则，有时如分叶状核，多数细胞有巨大核仁，核质内以常染色质为主，可见染色质间颗粒；③胞质中可见糖原颗粒，有丰富的线粒体，线粒体内有时见包涵物。胞质丰富，内有分泌颗粒，胞质内粗面内质网发达，可见黏液分泌颗粒，有时可见细胞内微囊，表面有少量微绒毛。
       2.3  两肺癌细胞株用药后的形态变化大致相同多数细胞胞体变小，形态不规则，胞质电子密度增高，髓鞘样结构较多见。细胞核内染色质边集，基质电子密度增高。核形变得极不规则，核仁消失，细胞器减少或变形、结构不清。少数细胞体积增大，表面微绒毛消失，部分细胞膜呈线性中断。核内异染色质分界不清，局部核质分界不清，核仁呈均一电子密度，网状结构消失。线粒体呈气球样肿胀，嵴减少或消失。粗面内质网几乎见不到，质膜结构不清或断裂消失。细胞质可见电子密度降低，提示细胞内水肿。另见少量小的细胞碎片，有包膜包裹，可见高电子密度的团块，无细胞器结构。
       3  讨论
       化疗是治疗肺癌的主要手段之一。然而由于耐药性的存在多数患者的疗效并不理想。同时传统的化疗药物剧烈的毒副作用又使相当一部分病人难以忍受整个疗程而被迫中途停止。化疗药物的昂贵价格又使许多家庭难以承受。以上种种原因使众多医学工作者近年来把目光转向了抗癌中药。祖国医学对肿瘤的治疗有其独特的优势，既注意标本兼治，又注意调理阴阳增强机体免疫能力。应用瑞香狼毒治疗肿瘤在我国古代医学典籍中早有记载，《本经》中就有：“狼毒破积聚,治恶疮,消蛊毒”的论述，又有逐水、祛痰、破积、杀虫之功效［1］。 当前，随着研究技术的不断进步，国内外学者对瑞香狼毒抗肿瘤作用及机制进行了深入系统地研究，并取得了突破性的进展。以往的研究多从瑞香狼毒提取物对各种不同类型肿瘤细胞的抑制率以及瑞香狼毒不同单体成分的抗癌活性等方面进行研究［2～7］。我们从超微结构水平观察瑞香狼毒水提取物对肺癌细胞超微结构的影响，发现用药后肺癌细胞的形态、细胞核及细胞器都有不同程度的改变。
       
       两肺癌细胞株多数细胞表现为胞体缩小，形态不规则，胞质电子密度增高。细胞核内染色质边集，基质电子密度增高。核形变得极不规则，核仁消失，细胞器减少或变形、结构不清，表明瑞香狼毒提取物主要导致肺癌细胞发生固缩性死亡。而同时又发现少数癌细胞体积增大，细胞器肿胀，说明其中有一部分细胞发生了水变性。我们推测可能是瑞香狼毒作用细胞后早期的变化，或是处于不同细胞周期的肺癌细胞对瑞香狼毒提取物的敏感性不同所致。
       
       本研究表明,瑞香狼毒水提取物对肺癌细胞具有明显的细胞毒作用。是否对其它化疗药物有增敏或协同作用及其作用机制有待进一步研究证实。
       【参考文献】
         　　［1］ 罗慧英，王爱勤. 不同极性溶媒瑞香狼毒提取物的抗肿瘤活性比较［J］.中国临床药理学与治疗学，2005，10(10)：1140.
       
       ［2］ 马 健,李永华.瑞香狼毒提取物逆转人肝癌耐药细胞多药耐药的实验研究［J］.中国中医药科技，2004，11（4）：223.
       
       ［3］ 谢 华,贾正平,徐丽婷，等. 瑞香狼毒水提物小鼠的药物血清对K562细胞增殖的影响［J］.中国药房，2001，12（7）：400.
       
       ［4］ 王润田,张坤娟,佟 慧，等. 瑞香狼毒甲醇提取物抗瘤机理研究［J］.中华微生物学和免疫学杂志，2003，23（9）：734.
       
       ［5］ 刘志敏,李树学,徐 杰. 瑞香狼毒复方提取液对小鼠腋下移植肿瘤的抑制作用［J］.中医药信息,2000,17(1)：56.
       
       ［6］ Feng WJ, Fujimoto Y, Ohkawa M,et al. Antitumor principles of Stellera Chamaejasme L［J］. Chinese Journal of Cancer Research, 1997, 9(2)：89.
       
       ［7］ 冯威健,池川哲郎,吉田光二. 瑞香狼毒提取物尼地吗啉的抗癌活性［J］.中华肿瘤杂志，1995,17(1)：24.