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       【摘要】 
       目的 建立首乌精口服液中2，3，5，4’四羟基二苯乙烯2OβD葡萄糖苷含量的高效液相色谱（HPLC）测定方法。方法色谱柱为Waters公司SymmetryC18柱（3.9 mm×250 mm，5 μm），流动相为乙腈-水（17∶83），流速1.0 ml/min，检测波长为320 nm。结果2，3，5，4’四羟基二苯乙烯2OβD葡萄糖苷在0.45～1.8 μg范围内线性关系良好(r=0.999 987)，8 h的RSD为0.7%。结论 该方法量测首乌精口服液中有效成分二苯乙烯苷的含量，灵敏度高、定量准确、方法简便、重现性好，能有效地控制首乌精口服液制剂质量。
       【关键词】  何首乌； 二苯乙烯苷； 高效液相色谱； 含量测定
       基金项目：江苏省南通市科技创新计划项目（No.A04031）
       HPLC Content Determination of Stilbenes in Shouwujing Oral Solution
       LI Hongjuan, WANG Chunhua,ZHANG Wei*
        
       (Medical College in Nantong University, Nantong, Jiangsu,226001,China)
       Abstract：ObjectiveAn HPLC method was established for the determination of 2，3，5，4"tetrahydroxystilbene2OβDglucopyranoside in Shouwujing Oral Solution．MethodsA Symmetry- C18 column(3.9 mm×250 mm，5 μm)with a mobile phase composed of acetonitrilewater(17∶83)was used．The detection wavelength was 320 nm and the flow rate was 1.0 ml/min ．Results The calibration curves were linear between 0.45～1.8 μg (r=0.999 9)，the 8 hours" precision RSD was 0.7% ．ConclusionThe method is simple，rapid and accurate and is suitable for the determination of 2，3，5，4"tetrahydroxystilbene2OβDglucopyranoside in Shouwujing Oral Solution．
       Key words：Polygonum multiflorum Thunb.；  Stilbenes；   HPLC；   Content determination
       
       首乌精口服液由何首乌醇提取后加入香精等辅料稀释到一定浓度而得到,具有乌须发、悦颜色、养精血、抗衰老之功, 其有效成分二苯乙烯苷具有显著的药理活性［1］。现代药理研究证明：首乌及其所含的二苯乙烯苷化合物具有抗衰老，提高免疫功能，防治动脉硬化及保肝等作用［2］。临床应用研究表明：二苯乙烯苷在防治中老年疾病如高脂血症、高血压、慢性气管炎、糖尿病；精神神经性疾病如神经衰弱、癫痫等诸多方面均具有较为显著的疗效［3］。为控制产品内在质量，采用HPLC对何首乌的活性成分二苯乙烯苷进行含量测定的研究，现报道如下。
       1  器材与试剂
       
       Waters高效液相色谱仪，Waters 1525 Binary 泵，AUTOSAMPLER 717 进样器，Waters 2487型双波长紫外检测器；M32色谱工作站；日本岛津AUW120D十万分之一电子分析天平；二苯乙烯苷对照品由成都思科华生物技术有限公司提供，其二苯乙烯苷含量大于98%。乙腈为色谱纯，流动相用水为超纯水， 口服液用水为蒸溜水，乙醇等为分析纯。
       2  方法与结果
       2.1  首乌精口服液制备 何首乌，四川地产药材，打粉，过60目筛。 称取何首乌粉末100 g置于容量瓶中，量取55%的乙醇700 ml加入容量瓶中（固液比为1∶7）后，静置浸润30 min，在75℃ 加热回流，乙醇提取时间为45 min，冷却、静置让其充分沉淀后过滤，弃去滤渣。然后将提取液用旋转蒸发仪回收乙醇并浓缩， 55～60℃真空浓缩提取液，室温下静置24 h后，取上清液放入圆底烧瓶中，并加入适量蒸溜水定容至刻度得口服液母液, HPLC测定其二苯乙烯苷含量,将其稀释至0.1%，加入防腐剂等，调节pH至7.0～7.5，滤过，灌封，灭菌，即得首乌精口服液30   mg（含二苯乙烯苷）/10 ml/支。
       2.2  色谱条件 色谱柱为SymmetryC18（3.9 mm×250 mm，5μm），流动相为乙腈水（17∶83），流速为1.0 ml/min，测定波长320 nm，柱温30℃。理论塔板数按二苯乙烯苷峰计算应不低于4500。二苯乙烯苷对照品及首乌精口服液（供试品）的色谱图见图1。
       图1  HPLC图（略）
       2.3  溶液的制备
       2.3.1  对照品溶液的制备  精密称取二苯乙烯苷对照品1.35 mg置于已干燥至恒温的10 ml的容量瓶中，加50%的乙醇定容至刻度，摇匀，用0.45 μm的微孔滤膜过滤备用。
       2.3.2   供试品溶液的制备  精密吸取自制二苯乙烯苷100 μl置于已干燥至恒温的10 ml的容量瓶中，加50%的乙醇定容至刻度，摇匀，用0.45 μm的微孔滤膜过滤备用。
       2.3.3  空白实验 空白溶液的制备是按处方各种成分的比例，自配不含何首乌的口服液，按其工艺制成阴性对照，再按供试品溶液制备方法制备并测定。结果空白溶液在与二苯乙烯苷对照品相同保留时间处无色谱峰，故认为无干扰。
       2.4  线性关系考察  将对照品溶液1 ml装入1-5号进样管，分别取3，6，9，12，15  μl进样，记录色谱图和各浓度相应的峰面积值，以二苯乙烯苷对照品含量(X)对峰面积值(Y)绘制标准曲线，经统计学处理求得回归方程为：Y=4.73e+006X-2.12e+005，r=0.999 987，结果表明二苯乙烯苷在0.45～1.8 μg线性关系良好。本法用外标法计算含量。
       2.5  稳定性实验 取供试品溶液，间隔约2h分别于0，1，3，5，8 h进样10μl, 测得二苯乙烯苷的含量依次为7.32,7.26,7.22,7.17,7.11 mg/ml,平均值为7.22 mg/ml，RSD为0.7%。测定结果表明样品在8 h内基本稳定。
       2.6  精密度实验  精密吸取同一对照品溶液10 μl连续进样5次，测定峰面积积分平均值为2.999×106,峰面积的RSD为0.4%。
       2.7  重复性实验精密称取同批样品5份(每份约1 ml)，按2.3.2项供试品溶液的制备方法制备及上述色谱条件测定，测得平均含量为7.53 mg/ml，RSD为0.9%(n=5)，结果表明此法重复性良好。
       2.8  加样回收率实验采用加样回收法精密称取已知含量的同一批号的样品5份，精确加入二苯乙烯苷对照品(0.675 mg/ml)，按2.3.2项供试品溶液的制备方法制备及上述色谱条件测定。结果见表1。
       表1  二苯乙烯苷加样回收率测定（略）
       样品含量均为0.753 mg，加入量均为0.675 mg，n=5
       2.9  样品测定  分别精密吸取对照品溶液与样品供试品溶液各10 μl，以上述色谱条件，测定3批样品。测定含量见表2。
       3  讨论
       
       据文献报道［4］，二苯乙烯苷色谱峰的光谱吸收曲线在(320±1) nm有最大吸收；本实验曾用紫外—可见分光光度法对二苯乙烯苷对照品溶液在200～420 nm波长进行扫描测定，最大吸收波长在320 nm处，因此选择320 nm为检测波长。
       
       关于色谱条件，结果表明，流动相为乙腈水(17∶83)，流速为1.0 ml/min时，二苯乙烯苷色谱峰达到了满意分离，理论塔板数为4 535，分离度为8.61，拖尾因子为1.31，因此将此色谱条件定为口服液含量测定的最佳条件。
       表2  不同批次二苯乙烯苷含量测定（略）
       据文献报道［5］，二苯乙烯苷对光不稳定，在pH 7.0～7.5水溶性、室温条件下稳定，因此，对首乌精口服液含量测定时，宜在避光条件下进行，并使用棕色器皿；供试品、对照品溶液应在临用前配制，并调节其pH在7.0～7.5之间，柱温控制在30℃，以减小误差。
       
       应用Symmetry- C18色谱柱，其用高纯硅胶填料，具有良好的色谱峰形、高重现性及长柱寿命、并具有良好的用户背景的特点。
       
       本研究采用HPLC测首乌精口服液中有效成分二苯乙烯苷含量，灵敏度高、定量准确，方法简便，重现性好，能有效地控制首乌精口服液制剂质量。
       【参考文献】
         　　［1］ 陆蕴如，邓巧虹，车秋芳，等.何首乌及其制剂中2，3，5，4-四羟基二苯乙烯2OβD葡萄糖甙含量测定研究［J］.北京中医药大学学报，1998，21(6)：31.
       
       ［2］ 李玉芳，和玄华.何首乌现代研究进展［J］.中成药，1997，19（5）：37.
       
       ［3］ 邓文龙，龚世荣.何首乌研究进展［J］.中草药，1987，18（3）42.
       
       ［4］ 鲁 静，粟晓黎，董海荣，等.高效液相色谱法测定何首乌及制首乌中羟苠衍生物的含量［J］.药物分析杂志，2O00，20(2)：104.
       
       ［5］ 班 翊，刘其礼，金 悠，等.二苯乙烯苷的稳定性研究［J］.中草药，2004，35（11）：1235.