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       【摘要】 
       目的观察加味四逆散对肝组织Ⅰ，Ⅲ型胶原mRNA影响，探讨其抗肝纤维化的药理机制和作用。方法采用二甲基亚硝胺腹腔注射制备大鼠肝纤维化模型，加味四逆散灌胃给药，采用实时定量PCR技术检测各组大鼠肝组织Ⅰ，Ⅲ型胶原mRNA表达的水平。结果加味四逆散能明显降低肝纤维化大鼠肝组织Ⅰ，Ⅲ型胶原的含量，与病理模型组比较有显著性差异（P<0.05）。结论 加味四逆散可有效的减少肝组织Ⅰ，Ⅲ型胶原的生成，对肝纤维化有肯定的治疗作用。
       【关键词】  加味四逆散； 肝纤维化； Ⅰ型胶原； Ⅲ型胶原
       The Effects of Jia Wei Si Ni San on Expression of Collagen Ⅰ,Ⅲ of Hepatic Fibrosis in Rats
       ZHENG Xurui, WEI Yonghong, ZHOU Liying, SUN Shoucai, YU Wenya
       (Shanxi University of TCM, Xianyang, Shanxi 712046, China; China Academy of Chinese Medical Sciences, Beijing 100700, China)
       Abstract：ObjectiveThe mechanism of Chinese  Herbail  compound  JLA WEI SI  NI  SAN  in  treating  hepatic  fibrosis  were  further  explored  and  studied  by  observing  the  expression  of  Collagen Ⅰ and  ⅢCollagen  mRNA  in  liver.MethodsThe  rat  fibrosis  model  was  induced  by  DMN.The  groups  of  treatment  were  fed  with  JWSNS  gavage.Collagen  I mRNA  and  Collagen  III mRNA were  detected  in  liver  samples  with  RTPCR.ResultsUpon  pathological  examination,the JWSIS  treatment  had  significantly  reversed  DMN-induced  liver  fibrosis.IN  JWSIS  treatment  group  the  expression  of  collagen  Ⅰ ， Ⅲ  in  liver  was  markedly  reduced  respectively  according  to  RTPCR  analysis  as  compared  with  model  group(P<0.05)  .ConclusionThe  mechanism  of  treating  hepatic  fibrosis  with  JWSNS  appears  to  be  due  to  the  enhancement  of  degradiation  of  collagen  in  liver.JWSNA  can  treat  hepatic  fibrosis  effectively.
       Key words：JWSNS;  Hepatic  fibrosis;  Couagon Ⅰ;  Couagen Ⅲ
       
       加味四逆散是治疗慢性病毒性肝炎的有效经验方，既往的临床观察和动物实验研究已经证实该方具有良好的防治肝纤维化作用［1～3］。本实验采用二甲基亚硝胺（DMN）腹腔注射诱导肝纤维化大鼠动物模型，应用实时定量PCR技术检测大鼠肝组织中I（CoLI）,Ⅲ型胶原（CoLⅢ）mRAN表达，探讨加味四逆散抗肝纤维化的作用机制。
       1  材料
       1.1  动物SD大鼠46只，雄性，清洁级，体重（180±20）g，由第四军医大学实验动物中心购进。动物合格证号：军医动字第20022020号。
       1.2  药品及试剂加味四逆散煎剂（由柴胡、枳壳、白芍、黄芪、丹参、桃仁）等药组成，由陕西中医学院附院药房购进，经本院药物鉴定教研室鉴定无伪劣品。药物加水浸泡常规煎煮，过滤，水浴蒸发至每毫升含生药3.5 g，置于4℃冰箱保存备用。秋水仙碱（云南医药集团云南药业有限公司生产，批号20020208）、TRIzol  Regent(Invitrogen公司)、RTPCR  Kit（大连宝生物工程有限公司）、二甲基亚硝胺（Sigma公司）。
       2  方法
       2.1  动物模型制备大鼠在适应性饲养1周后随机选取8只作为空白对照组（A组 ），其余38只均用DMN（用生理盐水稀释至5 mg/ml）以10 ml/kg体重腹腔注射，1次/d，每周连续3 d，连续4周。
       2.2  分组4周造模结束后，38只大鼠共死亡8只，死亡率为21.1%，将剩余30只造模大鼠随机分为：B组（病理模型组）10只；C组（秋水仙碱组）10只；D组（中药治疗组）10只。
       2.3  给药  A，B组以生理盐水4 ml/只灌胃；C组以秋水仙碱0.01 mg/kg体重灌胃；D组以加味四逆散煎剂10 ml/kg体重灌胃。以上各组用药均1次/d，连续用药30 d后结束。
       2.4  标本制作实验结束后取部分新鲜肝组织用10%甲醛固定，石蜡包埋，连续切片，厚5 μm。
       2.5  普通病理组织学观察参照中华医学会传染病寄生虫病分会（2000西安）制定的《病毒性肝炎防治方案》，病理组织学分级标准为：正常肝脏或无明显胶原纤维增生为“-”级；胶原纤维增生，中央静脉和汇管区有少量纤维索放散延伸，但无间隔形成为“+”级；胶原纤维增生，中央静脉和汇管区结缔组织变厚，由此向四周伸出纤维索，形成不完全间隔为“++”级；胶原纤维大量增生，有个别菲薄的完全间隔形成（假小叶），完全间隔较厚，假小叶大量形成为“+++”级。
       2.6  RNA抽提和RT反应实验结束后取部分新鲜肝组织，按照Trizol试剂说明提取总RNA，加入20 μl DEPCtreated水溶解，用紫外分光光度260/280进行样品的浓度测定和质量鉴定，电泳证实总RNA的完整性，取2 μg总RNA，按试剂盒（大连宝生物工程有限公司，RTPCRKit）说明书进行操作，合成cDNA。
       2.7  实时定量PCR（Real-time  PCR）根据目的基因Genbank中的已知序列用primer premier 5.0设计引物，由大连宝生物工程有限公司合成。引物序列如表1。
       
       Real-time PCR方法参考文献［4］。用ABI prime7000SDS软件求出各样本的CT值，再按公式Folds=(C1/C2)/(C3/C4)，求出各样本的Folds值（C1：处理样品，待测基因；C2：处理样品，看家基因；C3：对照样品，待测基因；C4：对照样品，看家基因。C1～4根据标准曲线把CT值换为模板原始浓度）。
       表1  PCR中应用的引物序列（略）
       2.8  统计学处理所有数据应用SPSS10.0软件处理，参数值用±s表示，组间比较采用t检验；等级资料采用Ridit分析（P<0.05为显著性差异）。
       3  结果
       3.1  加味四逆散对大鼠症状表现的影响实验期间空白组大鼠一直精神状态佳，皮毛光滑密泽，大便正常，进食无异常。所有造模组大鼠，则出现不同程度的精神不振，反应迟钝，饮食摄水明显减少，粪便稀薄，皮毛凌乱，缺乏光泽；治疗组于治疗3周后，大便逐渐干燥，进食、摄水增加，精神状态亦随之好转。
       3.2  加味四逆散对肝纤维化组织病理学的影响实验结束后，光镜下观察可见，空白对照组HE染色见肝组织结构清晰，胶原纤维染色仅于汇管区和中央静脉有少许胶原纤维存在。模型组HE染色见肝组织结构欠清晰，汇管区及小叶内中度炎性细胞浸润；胶原纤维染色显示汇管区大量胶原沉积，呈较宽的条索状纤维深入肝小叶。各治疗组大鼠仅见轻度汇管区炎症，胶原纤维染色显示纤维结缔组织增生程度减轻，与模型组比较有显著性差异（P<0.05）。说明加味四逆散组对肝纤维化有良好的治疗作用。结果见表2。
       表2  肝纤维化各组大鼠肝脏病理组织学变化（略）
       与B组比较，★P＜0.05
       3.3  定量PCR结果分析由表3可见，病理模型组、秋水仙碱组和加味四逆散组与空白对照组比较，CoLⅠ，CoLⅢ mRNA表达水平增高，差异均有显著性（P<0.05）。秋水仙碱组和加味四逆散组与病理模型组比较，CoLⅠ，CoLⅢmRNA表达水平较低，差异均有显著性（P<0.05）。
       表3  CoLⅠ，CoLⅢmRNA的表达（略）
       与A组比较，★P＜0.05 ；与B组比较，▲P＜0.05
       4  讨论
       
       肝纤维化是多种慢性肝病晚期共有的组织学变化，其显著的特征是细胞外基质（ECM）的显著增加和成分的改变，近年来研究发现星状细胞（HSC）是肝纤维化形成的关键。HSC活化后不仅细胞大量增殖，而且还表现为细胞个体分泌纤维能力增强，大量生成ECM，胶原是ECM的最重要成分，肝脏胶原主要是Ⅰ，Ⅲ，Ⅳ，Ⅵ型，其中以Ⅰ，Ⅲ型胶原为主。故减少胶原在细胞外的沉积可能阻止肝纤维化，本实验结果表明与空白对照组比较模型组肝组织中的CoLⅠ，CoLⅢmRNA表达高于正常对照组，而加味四逆散组与病理模型组比较CoLⅠ，CoLⅢmRNA降低。
       
       因此加味四逆散能够降低肝纤维化时肝组织中CoL-Ⅰ，CoL-ⅢmRNA的表达，从而干预肝纤维化时的胶原合成与降解代谢，发挥其抗肝纤维化的作用。
       【参考文献】
         　　［1］ 孙守才，刘光炜. 加味四逆散治疗慢性乙型肝炎肝纤维化的初步研究［J］.陕西中医学院学报，2001，24（1）：46.
       
       ［2］ 孙守才，李晓苗，曾福海，等. 加味四逆散防治大鼠免疫性肝纤维化的实验研究［J］.陕西中医学院报，2002，25（2）：45.
       
       ［3］ 孙守才，刘光炜，曾福海，等. 加味四逆散对肝纤维化大鼠血清透明质酸、层黏连蛋白、Ⅳ型胶原及肝脏超微结构的影响［J］.中国中医基础医学杂志，2002，8（11）：30.
       
       ［4］ Yin JL,Shackel NA,Zekry A,et al.Real-time reverse transcriptase polymerase chain reaction(RT-PCT)for measurement of cytokine and growth factor mRNA expression with fluorogenic probes or SYBR Green I［J］.Immunol Cell Biol,2001,79(3)：213.