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       【摘要】 
       目的研究木贼正丁醇提取物及提取剩余物对大鼠高脂血症及动脉粥样硬化早期主动脉平滑肌病变的影响。方法选用雄性SD大鼠,随机分为正常对照、病理模型、阳性药、木贼正丁醇提取物、提取剩余物组。复制食饵性早期动脉粥样硬化模型,用木贼提取物预防性给药,以吉非罗齐为阳性药对照。实验9周,测定血脂，光镜及电镜下观察主动脉平滑肌细胞形态学变化。结果木贼正丁醇提取物及提取剩余物组血清TG，VLDL较模型组显著降低。提取物两组平滑肌病变较模型组明显减轻。结论 木贼两种提取物均有降低血脂，影响动脉粥样硬化早期血管平滑肌细胞转型的作用。
       【关键词】  木贼提取物； 动脉粥样硬化； 血脂； 平滑肌细胞； 形态学改变
       基金项目：河北省科学技术研究与发展计划项目（No.06276102D-28）
       To Study the Effect of Two Kinds of Equisetum Extraction on Smooth Muscle Cells in Early Atherosclerotic Rats
       JIANG Xiujuan,SHI Jing,LIU Hong,ZHEN Yanjun*,HOU Jianming, NIU Liying, ZHANG Fengmei, LIU Zhimin
       (Basic Medical Teaching Department of Hebei Medical University ,Shijiazhuang  050091，China)
       Abstract：ObjectiveTo study the effect of two kinds of Equisetum extract on smooth muscle cells in early Atherosclerotic rats .MethodsFifty male,SD rats were divided into five groups： a normal group with standard chow diet and four other groups with a high fat diet .In these high fat diet groups,one group plus Gemfibrozil,the second group plus Equisetum extract,another one plus the rest of Equisetum extract.The plasma levels of blood were measured after nine weeks.Light microscope and electric microscope were adopted to assess the degree of morphological changes of smooth muscle cells.Results Two kinds of Equisetum extract could reduce the levels of serum TG and VLDL as compared with the model group. They could also reduce the proliferation of smooth muscle cells and the degree of atherosclerotic lesion. ConclusionTwo kinds of Equisetum extract have the effect of inhibiting the development of experimental atherosclerosis.
       Key words：Equisetum extract;   Atherosclerosis ;   Bloodlipid;   Smooth muscle cell ;   Morphological changes
       
       研究证实，中药木贼Equisetum hiemale L.水煎剂可通过保护血管内皮，改善动脉粥样硬化（atherosclerosis. AS）早期病变［1］。本实验进一步对木贼抗AS有效部位进行提取，并观察提取物对AS早期大鼠血脂及主动脉血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell，VSMC)形态学的影响。旨在探讨木贼的药理活性部位。
       1  材料与方法
       1.1  材料
       1.1.1  动物  健康成年雄性SD大鼠，体重180～200 g（由华中科技大学同济医学院实验动物学部提供，医学动物合格证号：SCXK(e)20040007，清洁级），50只。
       1.1.2   药品  木贼（购于石家庄市乐仁堂大药房），经河北医科大学中医学院中药系鉴定为正品。用蒸馏水1∶100，加热3 h，回流提取得木贼水煎剂，水煎剂用正丁醇(分析纯，由天津市北方化学试剂厂提供，批号：20050805 )萃取，正丁醇萃取液加热回收至干，用蒸馏水定容至1.25 g/ml生药备用；萃取后剩余部分浓缩至浓度为1.25 g/ml生药备用［1］；选用羟甲基纤维素钠（CMC）为溶剂配制吉非罗齐（Gemfibrozil 由保定古城制药厂提供，批号040625）CMC溶液，浓度：0.016 g/ml。
       1.1.3  试剂与仪器  全自动生化分析仪，试剂盒由日本协和株式会社提供。Olympus光学显微镜，日立H7500型透射式电子显微镜。
       1.2  方法
       1.2.1  动物分组与模型复制  动物适应性喂养1周后，随机分为：正常对照组，病理模型组，阳性对照组,正丁醇提取物组,提取剩余物组，每组10只。实验第1周起，正常对照组给予基础饲料喂养，其余各组分别给予等量高脂饲料喂养（87.48%基础饲料+10%猪油+2%胆固醇+0.5%胆盐+0.02%他巴唑），各组动物自由饮水。
       1.2.2  给药方法 造模同时，阳性对照组用0.1 ml·kg-1·d-1吉非罗齐溶液灌胃，正丁醇提取物组以木贼的正丁醇提取物0.1 ml·kg-1·d-1（生药12.5 g·kg-1·d-1）灌胃，提取剩余物组以提取剩余物0.1 ml·kg-1·d-1（生药12.5 g·kg-1·d-1）灌胃。正常组及模型组分别给予等量自来水灌胃，随体重增长调节药量,实验9周。
       1.2.3  血脂检测  实验9周后禁食12 h，眶后取血，分离血清，氧化酶法测胆固醇（TC），甘油三酯（TG）；化学修饰酶法测低密度脂蛋白（LDL），高密度脂蛋白（HDL）；极低密度脂蛋白（VLDL）为计算值。
       1.2.4  光镜样品制备  实验9周后，处死动物，于每只大鼠胸主动脉上段同一部位取材，以10%福尔马林固定，逐级酒精脱水，石蜡包埋，连续切片8～ 12个动脉横断面(厚4 μm)，HE染色，光学显微镜观察。
       1.2.5  透射电镜样品制备  动物经4%多聚甲醛灌注固定后，截取胸主动脉2 mm×3 mm大小,迅速投入4℃预冷的4%戊二醛固定，1%锇酸后固定，乙醇梯度脱水,环氧树脂包埋，做超薄切片，醋酸铀、柠檬酸铅双染色,透射式电子显微镜观察。
       1.2.6  统计学处理  全部数据采用±s表示,采用SPSS 11.5统计软件，进行方差分析。
       2  结果
       2.1  木贼提取物对血脂的影响模型组TC，LDL较正常组显著增加（P<0.01），TG，VLDL轻度升高；正丁醇提取物组TG，VLDL较模型组明显下降（P<0.01），TC,LDL亦有下降；提取剩余物组TG显著下降（P<0.01），VLDL降低（P<0.05），HDL明显上升（P<0.01），但阳性药和剩余物组未显示降低TC作用，见表1。
       表1  两种木贼提取物对各组大鼠血脂的影响（略）
       与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01；与正丁醇提取物组比较，△△P<0.01；n=10
       2.2  主动脉病理学观察
       2.2.1   光镜所见正常组内膜光滑，完整，中膜VSMC与弹力纤维极向一致,走行规律，无增生；模型组内皮细胞明显缺失,内膜层可见大量VSMC,其核的长轴垂直于内膜。中膜VSMC数目也明显增多,排列紊乱，双核细胞典型，核深染,细胞间基质丰富；木贼提取物两组内膜局部损伤，内皮缺失较模型组减少，中膜可见少量VSMC迁徙，增生，排列较规律。
       2.2.2   透射电镜所见正常组内膜完整，内皮下间隙清晰，中膜浅层VSMC形态规整，细胞核轻度扭曲,肌丝丰富（见图1）；模型组内皮严重受损，细胞脱失多见（扫描电镜另文描述），内皮下间隙不规则，VSMC高度变形，胞质呈多型性突起，可见典型的VSMC向内膜迁徙现象，胞突伸入内膜，将内皮拱起。转型后的VSMC胞体肥大，细胞器增多，肌丝明显减少，可见双核,核体积明显增大，形状极不规则，胞质中脂滴及髓鞘样结构多见（见图2）；阳性药组（见图3）及提取物两组部分内皮细胞脱落，与模型组相比，VSMC形态改变明显减轻，形状趋向规则，胞突及细胞器减少，未见双核及胞质内脂滴及髓鞘样结构，其中正丁醇提取物组VSMC病变改善显著（见图4～5 ）。
       图1  正常组VSMC（略）       
       图2  病理模型组VSMC（略）
       图3  阳性对照组VSMC（略）     
       图4  木贼正丁醇提取物组VSMC（略）
       图5  木贼提取物剩余组VSMC（略）
       3  讨论
       
       研究表明，高TG血症可产生小而密的低密度脂蛋白（sLDL）,降低HDL，加速LDL氧化［2］，OXLDL可直接损伤血管内皮细胞，引起血管VSMC的增生［3］；VLDL残粒与LDL一样能携带胆固醇酯进入动脉内膜层，被修饰为OXVLDL后参与内皮损伤，刺激中膜VSMC发生表型改变，分裂增殖，向内膜迁徙，吞噬脂质，形成泡沫细胞，AS早期病变形成［4］。
       
       本实验模型组动物TC，LDL和TG，VLDL升高的变化，显示高脂损伤已发生，光镜观察结果证实了内皮损伤与VSMC的增殖反应。电镜下的“多支性VSMC”［5］的形成是VSMC转型的形态表现，肌丝减少、细胞器增多、胞核及核仁肥大、双核,是VSMC转型和增生的结果，胞质内脂滴及髓鞘样结构是合成型VSMC吞噬脂质的标志。给予木贼干预后，两组动物血脂指标显示TG,VLDL下降幅度显著，正丁醇提取物有轻度降低TC、LDL的作用，提取剩余物无此作用。有文献报道木贼科植物-问荆水煎剂具有较好的降低TG的作用,对高TC影响较弱［6］，本实验血脂变化与之相符，提示药物可能通过降低TG、VLDL水平，减轻内皮损伤及对VSMC刺激。提取剩余物组升高HDL的作用明显优于正丁醇提取物组，表明两组提取物降脂作用环节有所不同。形态学观察表明，两种提取物均显示出对增殖VSMC的影响，VSMC去分化表型特征减弱，接近收缩型，其中正丁醇提取物作用优于提取剩余物。
       
       木贼水煎剂经正丁醇萃取所得部分主要为黄酮类有机物，萃取剩余无机成分中硅含量极高［7］，实验结果提示有机物抗脂质过氧化损伤效应优于无机物，表明木贼的不同成分，可能通过不同环节产生降脂、保护内皮、抑制VSMC转型和增殖的作用，上述发现为进一步研究木贼抗AS药理活性的确切部位提供了初步的实验基础。
       【参考文献】
         　　［1］ 甄艳军，安 杰，周晓红，等.木贼对动脉粥样硬化早期大鼠血清ⅠL1，ⅠL8及TNFα的影响［J］．中国老年学杂志，2003,23(8)：538.
       
       ［2］ 马建林，王冰雁，苏哲坦.甘油三酯致动脉粥样硬化的研究进展［J］.心脏杂志，2001，13(2)：150.
       
       ［3］ 蓝荣芳，刘正湘.Ox-LDL与动脉粥样硬化［J］.中国组织化学与细胞化学杂志,2002，11(4)：485.
       
       ［4］ 荊 涛.血管平滑肌细胞凋亡与动脉粥样硬化及其中药防治［J］.中国动脉硬化杂志，2003,11（3）：271.
       
       ［5］ 史景泉，陈意生，卞修武.超微病理学［M］.北京：化学工业出社，2005,3:169
       
       ［6］ 李德坤，李 静，李平亚,等.木贼科植物研究概况Ⅱ.药理活性［J］.中草药,2000，31（8）：附7.
       
       ［7］ 李淑惠，靳丹虹，李德坤，等.木贼科植物研究概况Ⅰ.化学成分研究［J］.中草药，2000,31（7）：附12.