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       【摘要】 
       目的对中药黄精及主要掺伪品长梗黄精进行鉴别，确保中药使用的安全有效。方法采用原植物鉴定、性状鉴定、显微鉴定和RAPD手段，对随机引物进行筛选，通过1.8%琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物。结果通过筛选23种RAPD引物，得到CTGGGGCTGA，GCTGGCTGAC，TCCCGAACCG 三种引物，经 PCR扩增产生足够的多态性谱带用于分析。结论 RAPD技术为黄精与长梗黄精的区分提供了分子鉴别依据。
       【关键词】  黄精 长梗黄精 显微鉴定
       Abstract：ObjectiveFor the safe use of Chinese traditional drug, Polygonatum sibiricum and its fake called P. filipes, were identified by a new method. MethodsCharacter identification, microscopic identification and RAPD were used. All of the samples were amplified by PCR system and separated by 1.8% electrophoresis. Results23 arbitrary premiers were evaluated for the analysis of RAPD the primers such as CTGGGGCTGA，GCTGGCTGAC，TCCCGAACCG could yield enough polymorphic bands for the analysis. ConclusionThe method RAPD can be used for the identification of P. sibiricum and P. filipes.
       Key words：Polygonatum sibiricum；   P. filipes;  Microscopic identification
       
       李时珍《本草纲目》记载黄精“补诸虚，填精髓”，并称黄精为“服食要药”。其味甘、性平，具有补脾润肺，益气养阴的功能。在唐《千金翼方》中，孙思邈以自己长寿的经验所拟延年益寿方中，黄精是入选频率极高的药物。中医常用于治阴虚肺燥、干咳久咳、肾虚早衰。现代药理研究证明，黄精能增加冠状动脉流量，改善心肌营养，防止动脉粥样硬化，现代用于治疗冠心病、动脉硬化、糖尿病、肺结核、再生障碍性贫血及病后体弱等病证，有良好的康复保健效能。现代中药技术对黄精的利用不仅保留了中医古方黄精地黄丸、二精丸等，还研制了各种复方制剂如滋肾蓉精丸、消渴降糖片等，广泛地应用于中医临床。
       
       黄精属在全世界约40种，我国有31种，分布于全国各地，尤以西南地区居多［1］。2005版《中国药典》记载中药黄精为百合科植物滇黄精Polygonatum kongianum Coll.et Hemsl.，黄精P. sibiricum Red.，多花黄精P. cyrtonema Hua.的干燥根茎［2］。在使用过程中，有许多掺伪品，如长梗黄精、卷叶黄精、小玉竹，误食必然不能达到临床疗效甚至引发中毒，本文采用传统鉴定方法和RAPD方法对黄精及其主要掺伪品进行区分，解决临床混用问题。
       1  材料与方法
       1.1  药品与器材
       1.1.1   试剂琼脂糖（Promega公司）；Taq酶、dNTP、引物、DL-2000，MgCl2，6×加样缓冲液、10×PCR缓冲液（宝生物公司）；溴化乙啶（EB）（Sigma公司）；三羟甲基氨基甲烷（Tris）（天津市凯通化学试剂有限公司）；其它试剂为分析纯。CTAB提取液〔2%（w/v）CTAB，100mM Tris-HCl, pH 8.0  20 mmol/L EDTA， 1.4M NaCl， 2%二巯基乙醇，pH 8.0〕。CTAB/NaCl溶液：（10% CTAB ,0.7 mol/L NaCl）CTAB沉淀液〔1%（w/v）CTAB, 50 mmol/L Tris-HCl, 10 mmol/L EDTA, pH 8.0〕。高盐TE缓冲液：（10  mmol/L Tris-HCl, 10 mmol/L EDTA, 1M NaCl, pH 8.0）。
       1.1.2  仪器万能研究显微镜（Olypus wvanox）；TGL-16G型台式高速离心机（上海医用分析仪器厂）；HH-42型快速恒温数显水箱 （常州国华电器有限公司）；UV-240 紫外分光光度仪（Shimadzu公司）；2400型PCR仪（GeneAmp公司）。凝胶电泳仪（DYY-Ⅲ33A型，北京市六一仪器厂）。
       1.1.3  材料材料采自天津、河北省、江西省和北京植物园等地。材料来源见表1。
       表1  材料来源（略）
       2  方法
       2.1  显微鉴定截取1～2 cm3的根茎，置于F.A.A固定液中固定24 h。取出后经一系列浓度的乙醇脱水，石蜡包埋，切片厚度确定为15 μm。用1%番红、2%淡绿染色24 h，中性树胶封片，拍照（横切放大倍数100×，针晶放大倍数400×）。
       2.2  提取样品的DNA取0.1 g植物根茎置于－80 ℃预冻40  min，待药材充分变硬、变脆，置于白瓷乳钵研磨，加入CTAB提取液（含2%二巯基乙醇），于65 ℃消化60 min，不断振荡，充分反应，加入等体积CHCl3∶异戊醇溶液（24∶1）。13 000 r/min离心5 min，取上层液加入1/10个体积65 ℃预热的 CTAB/NaCl溶液，加入 CHCl3∶异戊醇溶液（24∶1）提取，13 000 r/min离心5 min。取上层相加等体积CTAB沉淀液后于65 ℃水浴30 min，5 000 r/min离心10 min，取沉淀加入500 μl高盐TE溶液, 混匀，再加入0.6个体积-20 ℃预冷的异丙醇，振摇，12 000 r/min离心15 min，取沉淀，用80%乙醇清洗，挥干，用TE（10,1）溶解，得DNA储备液。将储备液稀释成5 ng·μl-1的模板DNA，置于-20 ℃备用。
       2.3  引物筛选及RAPD分析［3～5］选取23条随机引物，分别放入反应体系并按照下列比例，加入其它组分，其中模板DNA浓度为5 ng/μl。
       
       RAPD扩增反应总体积为25.2 μl：5 μl 5 ng/μl模板DNA，2.5 μl 10 μmol/L引物，2.5 μl各为2.5 mmol/L dNTPs，2.5 μl PCR缓冲液，3 μl 25 mmol/L MgCl2，0.2 μl Taq酶、9.5 μl高压水，混匀，扩增。扩增程序：第1阶段，预变性94℃，3 min；第2阶段，每个循环94℃变性1min，37℃退火1 min，72℃延伸2 min，共40个循环；第3阶段，72℃继续延伸4 min；4℃储存。
       
       配制1.8%琼脂糖凝胶（含EB），在1×TAE缓冲液中电泳，电泳电压70V，凝胶成像分析系统拍照。选取扩增效果较好的引物用作最终的分析。
       2.4  显微鉴定结果长梗黄精与黄精、多花黄精的显微特征极为相近，中柱维管束多为周木型或不完全周木型，少见外韧型。所采植物粘液细胞的大小、多少以及针晶束的大小，多少随种类、采集地点的不同而改变。可采用显微鉴定对其进行大体上的区分，然后从分子水平上对其差异进行研究。见图1～2。
       2.5   RAPD扩增图谱通过多次重复实验，选取结果稳定、重现性好的序列CTGGGGCTGA，GCTGGCTGAC，TCCCGAACCG作为RAPD分析的引物。见图3。
       
       用引物TCCCGAACCG扩增，在1000～2000bp，长梗黄精没有谱带，江西产多花黄精有一条谱带，贵州产多花黄精有两条谱带，可以区分多花黄精与长梗黄精，同时江西与贵州产多花黄精谱带不同，很可能存在种内分化。用引物CTGGGGCTGA扩增，在250～500bp，黄精得到1条谱带，长梗黄精得到2条谱带，可作为鉴别黄精与长梗黄精的依据。用引物GCTGGCTGAC扩增，黄精与多花黄精、长梗黄精谱带位置和数目仍然不同，可作为区分所采样品黄精、多花黄精与长梗黄精的分子生物学依据。
       图1  多花黄精P. cyrtonema（略）   
       图2  长梗黄精P. filipes （略）
       图3  RAPD分析的琼脂糖电泳图谱（略）
       3  讨论
       
       RAPD是20世纪90年代发展起来的分子标记技术，能客观地揭示供试材料间DNA的差异，操作简便、快速，多态带数目多，高质量的DNA是整个分析过程中最关键的一步，大量实验发现，选取样品内部组织，用乙醇浸泡、蒸馏水清洗，可除去任何可能的外源DNA，防止污染。样品可置于-80℃，充分粉碎细胞壁，即使部分样品放置一年以上，仍可提取到足够量的DNA进行分子生物学分析。
       【参考文献】
         　　［1］ 中国科学院植物研究所.中国植物志，第15卷［M］.北京：科学出版社，1978：52.
       
       ［2］ 国家药典委员会.中国药典，Ⅰ部［S］.北京：化学工业出版社, 2005：215.
       
       ［3］ 刘塔斯，李 钟，刘春林.用RAPD方法鉴别中药玉竹及其混淆品黄精［J］.湖南药学，2002，4(2)：88.
       
       ［4］ Moreno S，Martin J P，Otriz M.Inter-simple sequence repeats PCR for characterization of closely related grapevine germplasm［J］.Euphytica.1998，101：117.
       
       ［5］ Martins M, Sarmento D, Oliveira MM, et al. Genetic stability of micropropagated almond plantlets, as assessed by RAPD and ISSR markers ［J］.Plant Cell Reports, 2004, 23(7)：492.