文章标题 全文   多个检索词，请用空格间隔。

       【摘要】 
       目的建立妇炎康片的质量标准。方法采用薄层色谱（TLC）对制剂中的赤芍、延胡索、黄柏、丹参、苦参、莪术进行鉴别，采用高效液相色谱（HPLC）法测定芍药苷的含量。结果TLC可鉴别出赤芍、延胡索、黄柏、丹参、苦参、莪术的特征斑点；芍药苷线性范围为0.148 8～1.041 6 μg，平均回收率为100.28％（RSD＝1.21％）。结论该测定方法简便可行、重复性好，可作为妇炎康片的质量监控。
       【关键词】  妇炎康片 质量标准 芍药苷 薄层色谱 高效液相色谱
       Abstract：ObjectiveTo establish a quality standard for Fuyankang tablets. MethodsRadix Paeoniae Rubra, Rhizoma Curcumae, Radix et Rhizome Salviae Miltiorrhizae, Cortex Phellodendri Chinensis, Radix Sophorae Flavescentis, Rhizoma Corydalis were identified by TLC. The content of paeoniflorin was determined by HPLC. ResultsAll components could be detected by TLC. The paeoniflorin had the linearity in range of 0.148 8～1.041 6 μg, the average recovery was 1.83%, and RSD was 1.21%. ConclusionThe method is simple, feasible and reproducibile. It can be used as the quality control of Fuyankang Tablet.
       Key words：Fuyankang Tablets；  Quality Standard;  Paeoniflorin；  TLC；  HPLC
       
       中药保护品种妇炎康片由赤芍、丹参、黄柏、芡实、当归、土茯苓、山药等13味药组成，具有活血化淤、软坚散结、清热解毒、消炎止痛的功效，适用于慢性附件炎、盆腔炎、阴道炎、膀胱炎、慢性阑尾炎、尿路感染。妇炎康片现行国家标准仅延胡索、黄柏、丹参进行薄层鉴别及对苦参碱进行TLCS含量测定，但该处方药味较多，无法更为全面的监控制剂质量。为了更好地控制本制剂质量，适应国家质量标准提高行动计划，现采用薄层色谱法对赤芍、莪术、丹参、黄柏、苦参、延胡索进行定性鉴别，用高效液相色谱法对芍药苷进行含量测定，现报道如下。
       1  仪器与试药
       1.1  仪器Dionex Summit高效液相色谱仪(P680 HPLC Pump, ASI-100 Automated Sampled Injector,PDA-100 Phtodiode Array Detecter，UVD170U,STH585 Column Oven) Chromeleon数据处理系统，超声波清洗机（SB-5200,宁波新芝科器研究所），实验室专用超纯水机(重庆利迪现代水技术设备有限公司)。
       1.2  试药 芍药苷（批号：110736-200525）、小檗碱（批号：110713-200208）、苦参碱（批号：110805-200306）、延胡索乙素（批号：0726-200208）、原儿茶醛（批号：110810-200205）、赤芍（批号：121093-200402）、延胡索（批号：120928-200403）、黄柏（批号：121510-200501）、丹参（批号：120923-200509）、苦参（批号：121019-200304）、莪术（批号：121304-200301）等对照品或对照药材均购自中国药品生物制品检定所；乙腈（色谱纯），超纯水，其他试剂和试药均为分析纯。赤芍、黄柏、丹参、苦参、莪术等阴性样品，均由广州中医药大学新药开发研究中心自制。
       1.3  样品 妇炎康片（批号：20060320、20060510、20060511、20060512），由江门德鑫制药有限公司提供。
       2  定性鉴别
       2.1  赤芍的薄层鉴别取本品10片，研细，加甲醇25 ml，超声处理30 min，滤过，滤液蒸干，残渣加水20 ml使溶解，过AB-8型大孔吸附树脂柱（内径1.5 cm，长8 cm），以蒸馏水洗脱至无色；再用0.1%氢氧化钠溶液50 ml洗脱，继用水100 ml洗至中性；最后用30%乙醇50 ml洗脱，收集乙醇洗脱液，蒸干，残渣加甲醇1 ml使溶解，作为供试品溶液。另取赤芍对照药材0.5 g,赤芍阴性对照样品 2 g，同法制成赤芍对照药材溶液和赤芍阴性对照溶液。再取芍药苷对照品适量，制成含芍药苷0.25 mg的对照品溶液。吸取上述溶液各10 μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以氯仿-醋酸乙酯-甲醇-甲酸（40∶5∶10∶0.2）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5％香草醛硫酸溶液，加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品及对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，赤芍阴性对照溶液未见上述斑点。结果见图1。
       2.2  延胡索的薄层鉴别 取本品15片，研细，加乙醇25 ml，超声处理30 min，滤过，滤液蒸干，残渣加水20 ml使溶解，加浓氨试液调pH至10～11，加乙醚萃取3次，20 ml/次，合并乙醚液，挥干溶剂，残渣加乙醇1 ml使溶解，作为供试品溶液；另取延胡索对照药材0.5 g,延胡索阴性对照样品 3 g，同法制成延胡索对照药材溶液、延胡索阴性对照溶液；再取延胡索乙素对照品适量，制成含延胡索乙素0.25 mg的对照品溶液。吸取上述溶液各10 μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正己烷-氯仿-甲醇（7.5∶4∶1）为展开剂，展开，取出，晾干，以碘蒸气熏至斑点显色清晰，置紫外光灯（365 nm）下检视。供试品色谱中，在与对照品及对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，阴性对照溶液未见上述斑点。结果见图2。
       图1  赤芍的薄层鉴别（略）           
       图2  延胡索的薄层鉴别（略）
       2.3  黄柏的薄层鉴别 取本品10片，研细，同“2.2”方法制备供试品溶液；另取黄柏对照药材0.5 g，黄柏阴性对照样品 2 g，同法制成黄柏对照药材溶液、黄柏阴性对照溶液；再取小檗碱对照品适量，加氯仿制成含小檗碱0.25 mg的对照品溶液。吸取上述溶液各10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以苯-醋酸乙酯-甲醇-异丙醇-浓氨水（6∶3∶1.5∶1.5∶0.5）为展开剂，另一槽置等量浓氨预饱和，展开，取出，晾干，置紫外光灯（365 nm）下检视。供试品色谱中，在与对照品及对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，阴性对照溶液未见上述斑点。结果见图3。
       2.4  丹参的薄层鉴别 取本品15片，研细，加乙醇20 ml，超声处理30 min，滤过，滤液蒸干，残渣加0.2%盐酸20 ml，超声处理30 min，滤过，滤液加氯化钠3 g，振摇使溶解，加醋酸乙酯萃取2次，20 ml/次，合并醋酸乙酯液，蒸干，残渣加乙醇1 ml使溶解，作为供试品溶液；另取丹参对照药材0.5 g,丹参阴性对照样品 3 g，同法制成丹参对照药材溶液、丹参阴性对照溶液；再取原儿茶醛对照品适量，加乙醇制成含原儿茶醛0.5 mg的对照品溶液。吸取上述溶液各10 μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以苯-醋酸乙酯-甲酸（16∶10∶1.6）为展开剂，在10℃以下展开，取出，晾干，喷以2%三氯化铁-1%铁氰化钾（1∶1）溶液。供试品色谱中，在与对照品及对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性对照溶液未见上述斑点。结果见图4。
       图3  黄柏的薄层鉴别（略）               
       图4  丹参的薄层鉴别（略）
       2.5  苦参的薄层鉴别取本品10片，研细，加氯仿-氨水（20∶1）25 ml，超声处理30 min，滤过，滤液浓缩至1 ml，作为供试品溶液；另取苦参对照药材0.5 g，苦参阴性对照样品 2 g，同法制成苦参对照药材溶液、苦参阴性对照溶液；再取苦参碱对照品适量，制成含苦参碱1 mg的对照品溶液。吸取上述溶液各10 μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以氯仿-甲醇-氨水（5∶0.5∶0.2）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以碘化铋钾溶液，可见光下检视。供试品色谱中，在与对照品及对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性对照溶液未见上述斑点。结果见图5。
       2.6  莪术的薄层鉴别 取本品10片，研细，加甲醇20 ml，温浸30 min，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1 ml使溶解，作为供试品溶液；另取莪术对照药材0.5 g，莪术阴性对照样品 1.5 g，同法制成对照药材溶液、莪术阴性对照溶液。吸取上述溶液各10 μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-醋酸乙酯（93∶7）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，105℃烘约10 min。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性对照溶液未见上述斑点。结果见图6。
       图5  苦参的薄层鉴别（略）         
       图6  莪术的薄层鉴别（略）
       3  芍药苷的含量测定
       3.1  色谱条件 色谱柱：Phenomenex C18(2)；流动相：乙腈-0.1％磷酸（85∶15）；柱温：20℃；检测波长：230 nm；进样量：10 μl。
       3.2  对照品溶液的制备 精密称取芍药苷对照品1.86 mg，置25 ml量瓶中，用甲醇制成每毫升中含芍药苷0.074 4 mg的对照品溶液。
       3.3  供试品溶液的制备取本品20片，研细，取约1.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 ml，摇匀，称定重量，浸泡0.5  h，超声处理（功率250 W，频率250 kHz）30 min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失重量，滤过，取滤液，即得。
       3.4  专属性考察 取赤芍阴性样品按供试品溶液制备方法制备，进样，测定。图谱表明在该色谱条件下，阴性对照无干扰，结果见图7。
       图7  妇炎康片中芍药苷的HPLC图谱（略）
       3.5  线性关系 分别精密吸取上述对照品溶液2、4、6、8、10、12 μl进行色谱测定，按上述色谱条件测定峰面积，以峰面积（Y）对进样量（X）进行线性回归，结果各成分的线性关系良好。
       
       芍药苷回归方程为Y = 1 003.3X - 16.141，相关系数r=0.999 9，线性范围为0.148 8～1.041 6 μg。
       3.6  精密度试验精密吸取供试品溶液10 μl重复进样6次，测得峰面积积分值，结果芍药苷平均峰面积为642.32，RSD为1.77%，表明精密度良好。
       3.7  稳定性试验精密取上述供试品溶液10 μl，按上述色谱条件，分别在0，2，4，6，8，10 h测定各成分峰面积，结果芍药苷平均峰面积为655.14，RSD为1.09%，表明10 h内各成分较稳定。
       3.8  重现性试验按拟定的含量测定方法，对同一批样品（批号：20060320）平行做6份，并计算含量，结果芍药苷平均含量为0.409 mg/片，RSD为1.22 %，表明本方法有较好的重现性。
       3.9  加样回收率试验精密称取已知含量的同一批样品(批号：20060320) 6 份，精密加入对照品适量，按供试品溶液制备项下操作，按上述色谱条件测定含量，分别计算回收率。结果见表1。表明本法具有较好的加样回收率。
       表1  加样回收率试验结果（略）
       3.10  样品测定  取3批样品，研细，取约1.0 g，精密称定，按上述方法操作，制备供试品溶液，精密吸取供试品溶液10 μl，按上述色谱条件测定。结果见表2。
       4  讨论
       
       在赤芍鉴别中，由于本制剂药味较多，芍药苷易受其他成分的干扰，故应对样品进行纯化处理。参考文献［1～3］对供试品进行了分离纯化，主要为有机溶剂萃取、大孔吸附树脂柱层析。结果采用D101型大孔吸附树脂进行纯化效果较佳，其中以0.1％NaOH溶液进行洗脱，既不影响苷类成分的保留，又有效去除酚类、色素类成分，从而实现杂质干扰少，芍药苷不拖尾的目的，结果见图1。本实验曾结合高效液相色谱法，比较不同浓度的乙醇洗脱液对薄层色谱分离效果的影响，结果表明，5倍柱体积的30％乙醇可以洗脱出94％的芍药苷，而70%、95%乙醇洗脱效果相当，但芍药苷斑点存在拖尾现象。可能与芍药苷为高极性成分，采用低浓度乙醇即可将其从大孔吸附树脂柱上洗脱，而高浓度乙醇在洗脱芍药苷的同时，极性较低的成分也被洗脱，从而对芍药苷分离产生影响。
       表2  样品含量测定结果（略）
       在苦参鉴别中，我们发现苦参对照药材中生物碱斑点较多，而3批供试品斑点明显减少，见图5。分析原因可能为苦参中各种生物碱在水液中的溶解性不一，且各生物碱之间存在相互转化，例如氧化苦参碱易转化为苦参碱；文献［3］报道苦参药材中氧化苦参碱含量远高于苦参碱，但含苦参药材的复方水煮后，苦参碱含量反而远高于氧化苦参碱，并且随加热时间的延长比例明显增大。
       
       在莪术鉴别中，我们发现原有批次产品的莪术鉴别不够稳定，即不同批次样品薄层斑点浓度不一，甚至无法鉴别出。归咎主要原因为，妇炎康片原有生产工艺中山药、莪术粉碎入药，与水提浸膏混合进行加热干燥，干燥时间长，温度高，其对莪术挥发油稳定性影响较大，温度过高、时间过长均会破坏挥发油成分。故对干燥工艺参数进行优化，确定详细工艺参数，有助于保留莪术中的挥发油成分。根据以上结果，江门德鑫制药有限公司改进了干燥工艺，缩短干燥时间，降低干燥温度，生产了3批样品（20060510，20061011，20060512），其3批莪术鉴别结果稳定，可重复性强，见图6。
       
       工艺研究过程中我们发现，芍药苷在提取、浓缩过程中较为稳定，但在干燥过程中易受热氧化分解，温度越高、加热时间越长，芍药苷在制剂成品中保留越低，与文献［4］报道结果相符。分析原因可能为浸膏在干燥加热过程中与热空气接触面干燥速度较快，形成结块，而物料内部受热较慢，水分不易蒸出，压力升高，受热时间延长，物料中芍药苷氧化分解速度加快，故导致原有工艺所得的制剂成品中芍药苷保留率较低，且不稳定。我们通过对水提取浸膏进行喷雾干燥，得喷干粉，再与莪术、山药细粉混匀，与原有工艺水提取浸膏与莪术、山药细粉混合干燥，明显缩短了干燥时间，减少了芍药受热的时间，提高了其在成品中的保留率及稳定性。
       【参考文献】
         　　［1］ 桂双英，周亚球，柯仲成．D101型树脂对芍药苷吸附分离性能的研究［J］．中国实验方剂学杂志,2006，12(2)：284.
       
       ［2］ 刘永刚，金向群，叶 瑾，等．大孔树脂纯化赤芍总苷的研究［J］．中药材，2005，3：196.
       
       ［3］ 贾敏鸽，孙文基．苦参及其复方中苦参碱与氧化苦参碱的转化研究［J］．药物分析杂志，2003，23（2）：90.
       
       ［4］ 闫兴丽，张建军，李小燕，等．温度对白芍药材、白芍提取物及乾坤清颗粒成品中芍药苷含量稳定性的影响［J］．中草药，2003，34（2）：131.