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       【摘要】 
       目的研究蜈蚣提取物对宫颈癌HeLa细胞生长的抑制及其作用机制。方法观察不同浓度的不同蜈蚣提取物对宫颈癌HeLa 细胞的生长抑制情况：运用体外细胞培养技术，以不同浓度的蜈蚣提取物以及阳性对照药顺铂作用于培养的HeLa细胞48 h，采用MTT法测定细胞代谢率，以流式细胞术观察DNA含量和凋亡的变化情况，DNA片断化分析和Western Blot测定Bax，Caspase 3蛋白水平的表达。结果HeLa 细胞用4，8 ，16 mg/ml的乙醚、乙醇蜈蚣提取物处理48 h后，细胞存活率显著降低；DNA周期改变明显，亚G1峰与对照组有显著性差异；DNA-Ladder典型；Western Blot 提示蜈蚣提取物作用HeLa细胞后Bax，Caspase 3 蛋白表达，凋亡率显著增高。结论 中药蜈蚣乙醚、乙醇提取物在体外对宫颈癌HeLa 细胞的生长有明显地抑制作用，机制与改变细胞DNA周期，促进凋亡有关。
       【关键词】  蜈蚣提取物 细胞周期 DNA片断化 细胞凋亡
       Abstract：ObjectiveTo study the inhibitory effects and mechanism of centipede extract on proliferation of cervical cancer cell line HeLa.MethodsTo observe inhibitory-effect of different concentration extract on the growth of HeLa cell. By the method MTT to detect cell survival rate, by flow cytometry to observe the change of DNA cycle and apoptosis and to assay the DNA fragmentation and detect the protein Bax，caspase 3 by Western Blot in vitro cell culture．ResultsAfter HeLa cell had been treated with concentration centipede extract by aether or ethanol (4，8 ，16 mg/ml)for 48h，the survival rate decreased. The number of each cycle cells changed obviously, the sub-G1 peak between test and control group was significantly different, DNA-Ladder was typical, the protein Bax，Caspase 3 expressing, apoptosis rate increased significantly．ConclusionCentipede extract can inhibit the growth of HeLa cell which is related to inhibiting DNA synthesis, blocking cancer cell division growth and enhancing apoptosis in vitro.
       Key words：Centipede extraction；  Cell cycle；  DNA Fragmentation；  Apoptosis
       
       宫颈癌( cervical cancer)是常见的妇科恶性肿瘤。在一些地区随着人乳头瘤病毒(HPV)感染率的上升和社会生活的变化,其发病率有增高趋势,且明显趋于年轻化,同时腺癌发病比例有所上升。
       
       蜈蚣为传统的动物中药材，其药用始见于2000多年前《神农本草经》。近年来得到了更广泛的应用，特别是在抗肿瘤［1～3］、治疗肝炎、心血管疾病、糖尿病并发症及各种肿瘤等方面均有较好作用，引起人们对其进行更深入的研究［4～9］。本研究用蜈蚣的乙醚、乙醇提取物对宫颈HeLa细胞，增殖抑制和促进凋亡的作用及其机制进行研究，探讨蜈蚣提取成分的抗瘤活性。
       1  材料与方法
       1.1  材料
       1.1.1  细胞与试剂HeLa细胞株购自武汉大学中国典型培养物保存中心并在本院免疫学重点实验室传代保种。蜈蚣为湖北宜昌本地产，宜昌医药公司购进。阳性对照顺铂（cisplatin,DDP）为齐鲁制药有限公司产品（批号5110231DB）；RPMI-1640培养基为美国Gibco产；小牛血清为杭州四季青产品；噻唑蓝(MTT)为Sigma进口分装；DNA检测试剂盒为美国Coulter产品；鼠抗人Bax,Caspase 3的单克隆抗体( 单抗)为美国Santa Cruz 公司产品。
       1.1.2  仪器及材料酶标仪，瑞士Tecan产，GENios型；流式细胞仪，美国Beckman Coulter产，EPICS XL-4型；CO2培养箱，日本Sanyo产，MDF-75型；凝胶成像系统，美国Kodak公司产，Gel Logic 200型；转移脱色摇床，海门市林其贝尔仪器公司产，TS-8型；电泳仪，北京六一仪器厂，DYY-6C型；96孔和6孔板均为美国Corning Costar产品。
       1.2  方法
       1.2.1  蜈蚣提取物的制备醚提物：取多棘蜈蚣干燥虫体200 g，磨碎后于2 000 ml烧瓶中加乙醚1 000 ml, 35℃水浴回流4 h，再超声波破碎20 min，并用冰块降温（防止温度过高致蛋白变性和乙醚大量挥发而发生爆炸）。抽滤后滤液35℃下旋转蒸发回收乙醚,乙醚挥发完后剩下为蜈蚣的脂提物。残渣再用上述方法用乙醚提取两次,收集脂提物，合并置4℃冰箱中储存备用。
       
       醇提物：乙醚提取后的残渣于500 ml三角瓶中，每瓶70 g，加入30%的乙醇溶液200 ml,以120 r/min浸提4 h，超声波破碎20 min用冰块降温,抽滤得滤液，残渣再重复提取3次。滤液在40℃真空旋转使乙醇挥发完，后进行冷冻干燥得醇提物冻干粉，置冰箱中保存。
       1.2.2   MTT法测定药物对HeLa 细胞增殖的影响取对数生长的HeLa细胞以1×104/ml×200 μl/孔的接种量，在含10%小牛血清的RPMI-1640培养液的条件下，接种于96孔培养板，5%CO2 ，37℃，饱和湿度的二氧化碳培养箱中培养24 h。后分别加入生理盐水、顺铂（5，20，40 μg/ml）、蜈蚣醚和醇提取物（4，8，16 mg/ml）40 μl/孔混匀，各有6个平行孔，继续培养48 h，终止培养弃上清，PBS洗涤2次后加入无血清RPMI-1640培养液稀释的MTT（终浓度0.2mg/ml）混合液200 μl/孔，继续5%CO2，37℃孵育4 h，吸弃培养液,加入DMSO 200 μl/孔，在漩涡振荡器上混匀，10～30 min内在酶标仪492 nm读板得吸光度OD值，根据测得的OD值按下式计算药物对肿瘤细胞生长的抑制率 ：抑制率=（1 - 实验组OD值/ 对照组OD值）×100% 。
       1.2.3  流式细胞仪分析细胞各周期DNA含量变化及亚G1凋亡峰测定取对数生长的HeLa细胞以1×105/ml×2 ml/孔的接种量，在含10%小牛血清的RPMI-1640培养液的条件下，接种于6孔培养板，5%CO2，37℃温箱中培养24 h。后分别加入生理盐水、顺铂（5，20，40 μg/ml）、蜈蚣醚和醇提取物（4，8，16 mg/ml）400 μl/孔混匀，各有3个平行孔，继续培养48 h后，收集上清，与用0.25%胰蛋白酶和0.02%EDTA混合消化液收集的细胞悬液合并，用1×PBS以1 000 r/min,离心5 min洗涤3次，调整细胞浓度为1×106/ml。严格按照DNA试剂盒说明书操作，取上述细胞悬液100 μl，先加入200 μl 打孔、破膜剂混匀，10 s后再加入2 ml含RNase的PI染液混匀，室温暗处避光孵育染色20 min，经300 目尼龙网过滤后上流式细胞仪分析细胞周期和凋亡改变情况。结果用软件DNA Multictycle分析。
       1.2.4  DNA片断化分析取对数生长的HeLa细胞以1×105/ml ×10 ml/瓶的接种量，在含10%小牛血清的RPMI-1640培养液的条件下，接种于250 ml培养瓶，5%CO2，37℃温箱中培养24 h。后分别加入生理盐水、顺铂（5，20，40 μg/ml）、蜈蚣醚和醇提取物（4，8，16 mg/ml）2 ml /瓶混匀，继续培养48 h后，收集上清，与用0.25%胰蛋白酶和0.02%EDTA混合消化液收集的细胞悬液合并，用1×PBS以1 000 r/min × 5 min，4℃洗涤3次。上述细胞沉淀中加入DNA裂解缓冲液500 μl，充分混匀后4℃孵育20 min，12 000 r/min,离心10 min收集上清，加入等体积的酚-氯仿充分混匀抽提，12 000 r/min,离心10 min再次收集上清，后再加入1/10体积的3M的醋酸钠和2倍体积的无水乙醇，充分混匀，-20℃沉淀30 min，12 000 r/min,离心10 min收集沉淀，70%乙醇洗涤一次，室温干燥（10～20）min，加入含RNase的TE 缓冲液20 μl 37℃水浴30 min，-20℃储存。1.5%琼脂糖凝胶电泳，90 V电压下电泳1.5 h，凝胶成像仪观察结果。
       1.2.5  蛋白免疫印迹 (Western Blot)实验检测凋亡相关蛋白的表达细胞培养加药及收集如“1.2.4”项前半部分处理, 收获的HeLa细胞沉淀中加入蛋白裂解液100 μl, 冰上放置30 min,12 000 r/min 离心15 min, 取上清, 酶标仪OD595定量后置- 20℃备用。灌制10%SDS- 聚丙烯酰胺凝胶, 蛋白质变性，常规电泳分离蛋白质, 再将其转移到PVDF 膜上,脱脂奶粉封闭2 h 后, 加一抗( 1∶200) , 4℃孵育过夜, TBST 洗涤3次,15 min/次，加二抗（羊抗鼠IgG-HRP 1∶6 000)室温振荡2h, TBST 洗涤3次，DAB（二氨基联苯胺）显色。
       1.2.6   统计学分析采用SPSS10.0 软件进行t 检验分析。
       2  结果
       2.1  肿瘤细胞形态学变化分别于倒置显微镜下观察各加药组细胞与对照组细胞的形态改变情况。观察发现加生理盐水的阴性对照组细胞呈现梭形，生长旺盛密集，几近铺满板底或已长满，光泽度好；而加入不同浓度的蜈蚣提取物和阳性对照药物顺铂的细胞随药物浓度梯度呈现不同的抑制程度，细胞数量明显少于阴性对照组，光泽度下降，且凋亡发生率升高（细胞数减少,稀疏,细胞变小、变圆,核固缩等, 细胞失去贴壁生长的特性, 并且随着药物浓度的升高, 此现象更加明显，细胞由梭形逐渐变圆，胞浆皱缩，细胞体积缩小，凋亡小体形成）［10］，药物作用效果具有一定的时-效和量-效关系 。
       2.2  对HeLa 细胞的增殖影响不同蜈蚣提取物、顺铂以浓度依赖方式降低吸光度值，与对照组相比均有显著性差异(见表1)。说明蜈蚣醚、醇提取物能显著抑制HeLa细胞生长增殖，降低细胞活性，促进其凋亡。
       表1  MTT法测定不同浓度蜈蚣提取物和顺铂对HeLa细胞生长抑制率（略）   
       *与对照组比较，P＜0.05；λ=492 nm
       2.3  流式细胞仪检测凋亡率变化和细胞周期DNA含量细胞周期动力学结果显示，正常生长的宫颈癌HeLa细胞绝大多数处于G0-G1期（64.3%）, G2-M期细胞少（仅占35.8%），不见凋亡细胞［11］。蜈蚣醚、醇提取物和顺铂处理HeLa细胞后G0-G1期细胞比例减少，而G2-M期细胞明显增加，细胞周期被阻滞于G2-M期，与Park 等的报道相近［6，7］，并呈现一定的时效关系。提示诱导肿瘤细胞凋亡, 将肿瘤细胞阻滞于G2-M期可能是蜈蚣抗肿瘤活性的重要形式之一。DDP 也可诱导HeLa细胞凋亡,并将细胞阻滞于G2-M期, 且G2-M期细胞比率也随DDP 浓度的升高而增加。见图1及表2。
       图1  流式细胞仪分析不同药物浓度处理HeLa细胞48h后周期DNA含量的变化（略）   
       2.4   DNA琼脂糖凝胶电泳收集各加药组和对照组HeLa细胞，提取片断化DNA，1.5%琼脂糖凝胶电泳结果显示各加药组细胞核DNA降解为180～200bp的片断，出现典型的凋亡细胞梯级格局（DNA Ladder），而对照组细胞DNA无断裂现象，见图2。
       2.5  Western Blot 检测结果显示凋亡相关基因的表达。蜈蚣醚和醇提取物和顺铂作用于HeLa细胞，Bax和Caspase 3的表达阳性，见图3。
       表2  不同浓度蜈蚣提取物和顺铂处理48 h后HeLa细胞各周期DNA含量的比较（略）   
       与对照组比较，*P＜0.05
       图2  不同药物处理HeLa 48 h后DNA电泳图（略）   
       图3  不同药物处理HeLa 48h后蛋白的表达（略）   
       3  讨论
       
       本实验表明，蜈蚣醚、醇提取物在体外实验中使宫颈癌HeLa细胞DNA含量各期明显改变，凋亡率增高，凋亡相关蛋白Caspase 3，Bax表达，证实其有较强的体外抗肿瘤活性；具抑制增殖和促凋亡的双重效应，与阳性对照药顺铂相似［12～14］。其机制可能是通过影响癌细胞的DNA合成，阻止瘤细胞的分裂增殖，并促进其凋亡，从而进一步抑制了肿瘤细胞的生长。由于DNA损伤能导致细胞G2期阻滞并随后发生凋亡，推测蜈蚣造成DNA不可逆损伤使细胞周期停滞参与了凋亡过程。鉴于G0期肿瘤细胞是肿瘤复发的根源，G1期细胞减少会导致细胞增殖的抑制，蜈蚣使HeLa细胞G0-G1期比率降低，提示蜈蚣可能会降低宫颈癌细胞的复发，用于宫颈癌的化疗。
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