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       【摘要】 
       目的考察用合煎（传统汤剂）、分煎（配方颗粒汤剂）方法制备的鸭掌散汤剂中麻黄碱含量的变化，并比较其体外抗菌作用。方法①建立高效液相色谱方法，采用Diamonisl C18柱 (250 mm×4.6mm，5 μm)，乙腈-0.1%磷酸（5∶95）为流动相，流速1ml/min，检测波长207 nm。分析鸭掌散合煎液和分煎液样品中麻黄碱的含量变化。②采用稀释法体外测试鸭掌散不同煎液对常见菌种的最低抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC)。结果①鸭掌散分煎液中麻黄碱的平均含量大于合煎液中麻黄碱的平均含量。②鸭掌散分煎液对福氏痢疾杆菌有抑菌作用，而合煎液没有；合煎液对白色葡萄球菌、黄曲霉菌的抑菌作用大于分煎液。结论与传统汤剂比较，鸭掌散配方颗粒汤剂中麻黄碱的含量较高，抗菌谱较广。
       【关键词】  鸭掌散； 麻黄碱； 合煎； 分煎； 高效液相色谱； 体外抗菌
       Determination of Ephedrine Hydrochloride in Different Decoction Solutions of Ya Zhang Powder by HPLC and the Comparison of the Anti-bacterial Effects in Vitro
        YE Shiyun1, FENG Hua1, TIAN Weiyi1, WU Kongyun2, JIN Fengyun1, HE Zhuying1, LIANG Guangyi1,3*
        （1.Guiyang College of Traditional Chinese Medicine, Guiyang 550002, China；2.Guiyang College, Guiyang 550005, China；3.The Key Laboratory of Chemistry for Natural Products of Guizhou Province and Academy of Sciences，Guiyang  550002 China）
        Abstract：ObjectiveTo investigate the contents of ephedrine hydrochloride in combined decoction (mix the traditional Chinese herbs together, then boil them with water) and the separated decoction (boil the single traditional Chinese herb with water separately, then mix the abstracts) of Ya Zhang powder (composed of Ephedra sinica, Prunus armeniaca and Glycyrrhiza uralensis) and to compare their anti-bacterial effects in vitro. Methods①An HPLC method was established with a Diamonisl C18 column (250 mm×4.6 mm,5μm) and mobile phase of methanol-0.1% phosphoric acid（5∶95）.The flow rate was 1ml·min-1 and the detection wavelength was 207nm.②Minimal bacterial inhibitory concentration (MIC) and minimal bactericidal concentration (MBC) against the common bacteria in different decoctions were measured in vitro by employing dilution method.Results①The average content of ephedrine hydrochloride in the separated decoction was higher than that of the combined decoction. ②The separated decoction had the antibacterial effects to virulence of shigella flexneri, but the combined decoction did not; And to Staphylococcus albus and aspergillus flavus, the antibacterial effect of combined decoction was slightly stronger than that of the separated decoction. ConclusionCompared with that of the separated decoction, the content of ephedrine hydrochloride in the combined decoction was higher and the anti-bacterial effect was stronger.
        Key words：Ya Zhang powder;  Ephedrine hydrochloride;  Combined decoctions; Separated decoctions;  HPLC;  Anti-bacterial effects in vitro
        “鸭掌散”出自张时彻《摄生众妙方》，处方由麻黄、甘草、白果组成，有敛肺定喘、化痰等功效。本实验以中药经方“鸭掌散”中的有效成分麻黄碱作为考察指标，比较该方分煎法与合煎法制得的汤剂中麻黄碱含量差异以及体外抗菌活性的差异，探索中药复方汤剂不同制法对其有效成分溶出量的影响因素，亦对单味中药精制颗粒应用于临床提供一些理论依据。
       1  仪器与材料
        1.1  仪器安捷伦  1100型高效液相色谱仪，DAD检测器，1100/ WIND3D化学工作站。
        1.2  药材与试剂麻黄为麻黄科植物草麻黄Ephedra sinica  Stapf(河北)； 白果为银杏科植物银杏Ginkgo biloba L.（贵州）的干燥成熟种子；甘草Glycyrrhizauralensis  Fisch(新疆)。以上3味药材饮片经贵阳中医学院陈德媛教授鉴定，按照2005版《中国药典》规定方法测定含量符合要求。盐酸麻黄碱对照品(中国药品生物制品检定所，批号:714-9202)；乙腈（色谱纯），甲醇、磷酸（分析纯），水（娃哈哈纯净水）。
        1.3  试验菌种、培养基金黄色葡萄球菌、乙型溶血性链球菌、白色葡萄球菌、大肠杆菌、变形杆菌、伤寒杆菌、福氏痢疾杆菌、绿脓杆菌、白色念珠菌、黑曲霉菌、青霉菌，由贵阳中医学院微生物检测室提供。本实验采用普通肉汤培养基、普通营养琼脂、血琼脂平板、沙氏琼脂培养基、沙氏液体培养基及Ⅱ级生物安全柜、生化培养箱等。
           2  方法与结果
        2.1  色谱条件色谱柱为Diamonisl C18柱 (250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相为乙腈-0.1%磷酸（5∶95）；流速1 ml/min；检测波长为207 nm；柱温25℃［1］。
        2.2  溶液的制备及测定
        2.2.1  对照品溶液的制备精密称取盐酸麻黄碱对照品9.81 mg，置100 ml量瓶中，用甲醇溶解并定容。精密量取2 ml，置25 ml量瓶中，用流动相定容，配制成浓度为7.848 μg/ml的对照液，备用。
        2.2.2  合煎液样品溶液的制备(传统汤剂，使用传统煎煮法)称取药材饮片麻黄15.0 g，甘草12.0 g，白果10个，加8倍量的水煎煮，保持微沸30 min，倒出煎液；药渣再加8倍量的水煎煮两次，20 min/次，合并3次煎液,减压干燥成干粉。称取相当原药材处方量的干粉，置50 ml量瓶中，用开水溶解定容至刻度冷至室温。精密吸取2 ml，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 ml，密塞，称定重量，超声处理（功率160 W，频率50 kHz）20 min，放冷，用甲醇补足重量，摇匀，滤过。精密吸取滤液1 ml，置10 ml容量瓶中，加1滴磷酸，再用50%的甲醇定容，摇匀，用微孔滤膜（0.45 μm）滤过，即得［1］。
        2.2.3  分煎液样品溶液的制备（配方颗粒汤剂，煎煮方法由贵州宏宇药业有限公司提供）分别称取上述量的药材麻黄、甘草和白果。麻黄加10倍量的水煎煮保持微沸40 min，倒出煎液，药渣再加6倍量的水煎煮40 min；甘草加10倍量的水煎煮保持微沸60min，倒出煎液，药渣再加8倍量的水煎煮60 min；白果加10倍量的水煎煮保持微沸60 min，倒出煎液，药渣再加8倍量的水煎煮40 min；分别合并各药材的两次煎液，减压干燥成干粉。将各药材干粉混合均匀，称取相当原药材处方量的干粉，同合煎液样品溶液制备法制得分煎液样品溶液。
        2.2.4  阴性对照液的制备再分别按上法制备不含麻黄的合煎液、分煎液的阴性对照液。
        以上溶液各取10 μl按上述色谱条件进样分析。色谱图见图1。
        a-盐酸麻黄碱对照品  b-合煎液样品
        c-合煎液阴性对照液  d-分煎液样品
        e-分煎液阴性对照液              
        图1  5种溶液的HPLC图谱
        2.3  线性关系考察标准曲线的绘制:分别制成6个不同浓度盐酸麻黄碱对照品溶液。取10 μl注入液相色谱仪，测定峰面积，以峰面积积分值(A)对进样量(C)进行线性回归，得回归方程为A=2.071 6C+7.931 9，r=0.999 6。盐酸麻黄碱在62.784～188.352 μg间浓度与峰面积的线性关系良好。
        2.4  精密度实验精密吸取同一对照品溶液10 μl，重复进样6次，测定相应峰面积，RSD=0.8%。
        2.5  稳定性实验取供试品溶液，分别于0，2，4，6，8 h测定，合煎液RSD=0.5%；分煎液RSD=1.1%，表明两种供试品溶液在8h内稳定。
        2.6  重复性实验分别取同一样品干粉各6份，按相应样品液处理方法制备及测试条件测定，结果合煎液RSD=1.8% ,分煎液RSD=0.4%。
        2.7  回收率实验精密称取已知含量的合煎液样品和分煎液样品干粉各9份，分别加入3个不同浓度的盐酸麻黄碱对照品，按上述条件各制备9份供试液，稀释到25倍进行加样回收，过0.45 μm滤膜，并按色谱条件项下进样，同法测定。结果见表1～2。
        2.8  样品含量测定精密吸取同体积的合煎液、分煎液，按上法分别平行测定5次，求平均样品含量。盐酸麻黄碱在每个复方中的含量分别为合煎43.34 mg，分煎50.57 mg。用不同方法制备的鸭掌散汤剂中，麻黄碱的含量合煎液（传统汤剂）小于分煎液（配方颗粒汤剂）。表1  合煎汤剂盐酸麻黄碱加样回收测定结果表2  分煎汤剂盐酸麻黄碱加样回收测定结果
        2.9  体外抗菌实验
        2.9.1  菌株及药物的处理将上述细菌菌株分别用相应培养基常规转种培养24 h后，再用液体传代培养6 h，然后作1∶1 000稀释备用。黑曲霉菌和青霉菌用暴皿法收集培养，洗脱孢子，调整浓度为2×105个/ml备用。
        取适量鸭掌散合煎液干粉加入50 ml容量瓶中，加开水至刻度，摇匀，配成浓度相当于1 g药材/ml的合煎液溶液。
        取适量鸭掌散分煎液干粉加入50 ml容量瓶中，加开水至刻度，摇匀，配成浓度相当于1 g药材/ml的分煎液溶液。
        2.9.2  抗菌强度定性实验采用常规琼脂扩散管碟法定性测定该药的抗菌强度(接种试验菌液0.1 ml，药物用上述100%浓度原液，药物量200 μl)。结果见表3。
        2.9.3  抗菌强度定量实验采用试管法定量测定抗菌强度。每一菌株取干净试管10支，于第1管加入上述100%浓度药液和相应培养液1 ml，第2管至第8管各加入相应培养液1 ml。将第1管中药液混匀后沿2～8管做等倍稀释，至第8管混匀后吸取1 ml弃去，由此得到1∶2，1∶4，1∶8……1∶256的稀释度。第9管只加稀释菌液1.05 ml作阳性对照，第10管只加相应培养液1.05 ml作阴性对照。分别吸取稀释菌液0.05 ml加入第1管至第8管，混匀。常规培养后观察结果见表3。
       3  讨论
        采用HPLC法测定中药复方制剂中的麻黄碱，文献报道可用多种不同组成的流动相系统［2～4］，本实验选择《中国药典》方法，麻黄碱在10～12 min之间出峰，并与杂质峰能达到基线分离。
        鸭掌散有敛肺定喘、化痰等功效，麻黄有抗菌活性。因此，对鸭掌散合煎汤剂与分煎汤剂进行了麻黄碱含量和体外抗菌活性的对比研究。从以上研究结果可以看出，与鸭掌散合煎液相比较，分煎液中麻黄碱的含量较高。合煎液中的有效成分含量低是否是一个比较普遍的现象，还有待更深入广泛的研究才能确定。 表3  抗菌强度定性、定量实验结果黑曲霉菌（A）、白色葡萄球菌（B）、黄曲霉菌（C）、福氏痢疾杆菌（D）、金黄色葡萄球菌（E）、绿脓杆菌（F）、大肠杆菌（G）、变形杆菌（H）、伤寒杆菌（I）、白色念珠菌（J）、乙型溶血性链球菌（K）
        根据以上结果，合煎液对白色葡萄球菌、黄曲霉菌的抑菌作用略大于分煎液。分煎液对福氏痢疾杆菌有抑菌作用,而合煎液没有，可能是合煎液与分煎液的化学组成不同导致的，两种汤剂对不同细菌抑菌的差异还需要进一步的实验研究,为中药配方颗粒剂的临床应用提供更多的理论依据。
       【参考文献】
         ［1］ 国家药典委员会.中国药典，Ⅰ部［S］.北京:化学工业出版社,2005：223.
       
       ［2］ 郭东艳,史亚军,宋 逍.HPLC 测定复方麻黄止咳颗粒中盐酸麻黄碱的含量［J］.陕西中医,2005,26(4):373.
       
       ［3］ 郭长强,许礼贵,闫雪生,等.表实感冒颗粒质量研究［J］. 中成药,2005,27(5):538.
       
       ［4］ 李 外,杨立新,孙秀华.喘咳平颗粒中麻黄提取工艺研究［J］.北京中医药大学学报,2003,26(3):53.