文章标题 全文   多个检索词，请用空格间隔。

       【摘要】 
       目的建立黄药子配伍当归快速测定（HPLC/PDA/MS）色谱指纹图谱。方法应用Kromasil C18 柱，0.1 %乙酸水与纯色谱甲醇进行梯度洗脱，流速为0.8ml/min ，检测波长200～400 nm ，柱温为30℃。结果得到分离度、重现性均较好的黄药子配伍当归HPLC/PDA指纹图谱，标示了10个共有峰。应用HPLC/MS 技术对其6个主要色谱峰进行了初步归属。结论黄药子配伍当归指纹图谱的建立，为其吸收/代谢前后的活性/毒性变化情况提供了依据。
       【关键词】  黄药子配伍当归； 指纹图谱； 快速测定
       The Fingerprints of Dioscorea bulbifera L. and Angelica sinensis Diels by HPLC/PDA/MS
        ZHAO Yan1 , LIU Shumin2*
        (1.The Hospital of Daqing Oil Field, Daqing, Heilongjiang,China 163001, China; 2.Institute of Traditional Chinese Medicine, Harbin, Heilongjiang,China 150040, China)
        Abstract：ObjectiveTo establish the chromatographic fingerprints of Dioscorea bulbifera L.and Angelica sinensis Diels by HPLC/PDA. MethodsSeparation was carried  out on a Kromasil C18 column. Gradient elute was performed by the mobile phase consisting of 0.1 % acetic acid and colour spectrum methanol with the flow rate of 0.8ml/min. The column temperature was set at 30℃ and detecting wavelength at 200～400 nm.ResultsPerfect fingerprints were obtained which can be used for the Dioscorea bulbifera L. and Angelica sinensis Diels, ten common peaks were confirmed in fingerprints.Six compounds were elucidated by HPLC/MS. ConclusionThe method can be applied for internal absorption and internal metabolism of Dioscorea bulbifera L. and Angelica sinensis Diels.
        Key words：Dioscorea bulbifera L.and Angelica sinensis Diels;  Fingerprints;  HPLC/PDA/MS
        黄药子为薯蓣科植物黄独Dioscorea bulbifera L.的块茎，是可引起药源性肝损害的常用中草药之一，近年来有关黄药子的临床毒性屡见报道，本实验室在黄药子配伍当归可起到减毒作用实验研究的基础上［1］，进一步研究其指纹图谱，为其活性/毒性成分在吸收/代谢前后的变化的探索打下基础。
           1  仪器与试药
        1.1  仪器Waters 2695 LC/PDA/MS系统含在线真空脱气机、高压二元梯度泵、恒温自动进样器、柱温箱、二级管阵列检测器(PDA)、电喷雾离子化(ESI)接口，MICROMASS Quattro色谱工作站。
        1.2  试剂甲醇：色谱纯，德国Merck 公司；乙酸：分析纯；纯净水。
        1.3  药品黄药子购于黑龙江省药材公司，产地河北，经黑龙江省药检所鉴定，为薯蓣科植物黄独Dioscorea bulbifera L.的块茎。当归购于黑龙江省药材公司，产地安徽，经黑龙江省药检所鉴定为伞形科(Umbelliferae)当归Angelica sinensis Diels的根。
           2  方法
        2.1  供试品溶液的制备黄药子配伍当归（1∶2）饮片头煎10倍量水，浸泡2 h后，煎煮1 h，二煎8倍量水，煎煮1 h，合并煎液，浓缩，超速离心机8 000 r·min-1离心3 h，继续浓缩至每毫升含生药材0.5 g，冷冻干燥制成颗粒。给药时用蒸馏水溶解稀释至所需浓度，0.45 μm 微孔滤膜滤过，即得。
        2.2  参照物溶液的制备取阿魏酸对照品适量，用70%甲醇溶解,制成浓度为100 μg/ml 的溶液, 取黄独乙素对照品适量，用甲醇溶解，制成浓度为312 μg /ml 的溶液，取（+）表儿茶素对照品适量，用甲醇溶解，制成浓度为100 μg/ml 的溶液, 取金丝桃苷对照品适量，用甲醇溶解，制成浓度为200 μg/ ml的溶液。
        2.3  色谱条件及测定方法色谱柱：Kromasil C18柱(250 mm×4.6 mm ，5 μm)；流动相0.1 %乙酸水(A) 与甲醇溶液(B)；梯度洗脱：0～50 min(0～17% A)，50～90 min(17% A～40 % A) ,90～115 min(40%～80% A) ；115～135 min(80%～100% A)；135～145 min(100% A)；流速：0.8 ml/min ；检测波长：280 nm；PDA同时纪录200～400 nm紫外光谱，柱温：30℃；柱后分流0.2 ml/min 进质谱仪，同时记录总离子流(TIC) 图。离子极性:：ESI（+）ESI（-）；扫描范围:100～800；干燥气流速：10 L/min ；干燥气温度：350℃；雾化室压：40 pis ；毛细管电压：4000V；传输电压：70eV ；进样量10 μl 。
        2.4  方法学考察
        2.4.1  空白实验吸取50 %甲醇10 μl，注入高效液相色谱仪，记录色谱图，结果表明空白溶剂无干扰。
        2.4.2  参照物实验吸取参照物溶液10 μl，注入高效液相色谱仪，记录色谱图，其主峰的保留时间用于确定黄药子配伍当归中各对照品的峰位。
        2.4.3  稳定性实验取同一供试品溶液，分别于0，1，2，4，12 ，24 h进样检测。各主要色谱峰的相对保留时间和相对峰面积比值的RSD 均小于3% ，表明样品至少在24 h 内稳定。
        2.4.4  进样精密度实验取同一供试品溶液，连续进样6次。各主要色谱峰的相对保留时间和相对峰面积比值的RSD均小于3%，表明精密度良好。
        2.4.5  重复性实验取同一批药材，按“2.1”项下方法分别制备供试品溶液6份,进样检测。各主要色谱峰的相对保留时间和相对峰面积比值的RSD均小于3% ,表明方法的重复性好。
        3  结果
        黄药子配伍当归高效液相色谱可以分离出20个左右的峰，经比较所有测定的色谱图,从中选择了稳定性和重现性均较好的10个共有峰构成了指纹图谱的特征峰群(见图1)。为进一步研究指纹图谱中各谱峰归属，利用HPLC/MS 技术，对黄药子配伍当归供试品进行了质谱正负离子检测（见图2）。
        4 讨论
        4.1  HPLC/PDA/MS分析HPLC/PDA对照品实验表明，5号峰是（+）儿茶素，与对照品保留时间和光谱图最大吸收波长一致，根据TIC图提取质谱图（图3）中表现为m/z 289［M-H］- ； 6号峰是阿魏酸，与对照品保留时间和光谱图最大吸收波长一致，根据TIC图提取质谱图（图3）表现为m/z 193［M-H］-，m/z 178［M-CH3］-，m/z 165 ［M-CO］-，m/z 149［M-CHO］-等峰；8号峰是金丝桃苷，与对照品保留时间和时间光谱图最大吸收波长一致，根据TIC图提取质谱图（图3）表现为m/z 463［M-H］-；10号峰是黄独乙素，与对照品保留和时间光谱图最大吸收波长一致，根据TIC图提取质谱图（图3）中10号峰表现 m/z 344［M-H］-；根据TIC 图，提取质谱图(图3)及相关文献［2～4］,对其它主要色谱峰进行初步归属，1号峰推测为腺嘌呤.表现为m/z 134 ［M-H］-，m/z  115［M-H］-，m/z 108，m/z 66 等峰；2号峰推测为尿嘧啶，表现为m/z 112［M-H］-；3号峰推测为腺苷，表现为m/z 268［M+H］+，m/z 237，m/z 178，m/z 164，m/z 136［M–吡喃糖］；4号峰推测为L-色氨酸，表现为m/z 205 ［M+H］+ ，m/z 188［M-OH］+ 峰,并伴有m/z 161［M+28］+峰；7号峰推测为3，5-二甲氧基山萘酚，表现为m/z 317［M+H］+；9号峰推测为山核桃素，表现为m/z 329 ［M-H］-，m/z 314 ［M-CH3］-，m/z 125 。
        图3  黄药子配伍当归10个峰质谱图
        4.2  小结本文首次采用HPLC/PDA/MS对黄药子配伍当归的指纹图谱进行了研究，得到分离度、重现性均较好的药材指纹图谱,并利用HPLC/MS技术对10个主要色谱峰进行了初步归属，为今后与黄药子的指纹图谱进行拟合比较，确定活性成分、毒性成分变化规律，确定减毒作用物质基础打下扎实基础，也为研究其吸收/代谢前后的活性/毒性变化情况提供了依据。
       【参考文献】
         ［1］ LIU Shu-min,LI Yu-jie,LUO Ming-mei. The Detoxif ication Action of Chinese Angel ica Root to Dioscorea bulbif era L.［J］. traditional Chinese medicine and medical bind hepatopathy mangzine,2004,14(4):216.
       
       ［2］ Cong-Puzhu(Cong/Z). Application of mass spectrogram in naturalorganic chemistry［M］. BeiJing: science publishing,1987:656.
       
       ［3］ Gao Huiyuan ,Wu LiJun, Masanori Kuroyanagi. Sevencompounds from Dioscorea bulbif era L.［J］. NaturalMedicines,2001,55(5):277.
       
       ［4］ Y Ieda, S Kubo, M Fujita, T Komori, T Kawasaki. Furanoid norditer-penes from Dioscoreaceae plants, V. Structures of the diosbulbins-D, -E,-F,-G,and -H［J］.Justus L iebigsAnnalen der Chem ie,1978,5:818.