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       【摘要】 
       目的研究槲皮素诱导肝癌细胞SMMC7721凋亡，探讨其诱导SMMC7721细胞凋亡与survivin蛋白表达和caspase-3活性的关系。方法采用MTT法检测槲皮素对肝癌SMMC7721细胞生长的抑制作用，Hoechst 33258荧光染色对细胞凋亡进行形态学检测，流式细胞术检测细胞周期变化，免疫细胞化学检测survivin蛋白表达，分光光度法检测caspase-3的活性变化。结果槲皮素抑制肝癌SMMC7721 细胞增殖的作用明显，且呈浓度和时间依赖性，槲皮素处理48 h的IC50为84.24 μmol·L-1。形态学检测显示出细胞凋亡的特征变化，流式细胞仪检测表明经槲皮素处理，肝癌SMMC7721 细胞周期阻滞于G0/G1期，且SMMC7721细胞survivin蛋白表达下降，caspase-3活性升高。结论槲皮素能诱导SMMC7721细胞凋亡，其机制可能是使肝癌SMMC7721 细胞周期阻滞于G0/G1期，并下调survivin蛋白的表达，直接激活caspase-3而诱导SMMC7721细胞凋亡。
       【关键词】  槲皮素； 肝癌细胞SMMC7721； 细胞凋亡； Survivin； Caspase-3
       Regulation of Survivin in Apoptosis of SMMC7721 Cells Induced by Quercetin
        TAN Jun1,2，    ZHU Liancai1，WANG Bochu1
        (1. Bioengineering College, Chongqing University, Chongqing 400030，China；2. Department of Life Science and Chemistry, Chongqing Educational College, Chongqing 400067，China)
        Abstract：ObjectiveTo investigate the apoptosis of SMMC7721 hepatic cancer cells induced by quercetin and its relationship with the expression of survivin and activity of caspase-3.MethodsInhibitory effect of quercetin on SMMC7721 cells was detected by MTT assay. Morphological changes of apoptotic cells for Hoechst staining were observed by fluorescence microscope. Cell cycle was analyzed by flow cytometry (FCM). Expression of survivin protein was detected by immunocytochemistry staining. Activity of caspase-3 was analyzed by colorimetry. ResultsQuercetin had a significant inhibition on growth and proliferation of SMMC7721 cells in a concentration- and time-dependent manner. The IC50 was 84.24 μmol·L-1 after cells were treated with quercetin for 48h. evidence was provided that apoptosis occurred in SMMC7721 cells treated with quercetin using fluorescence microscope. It was suggested that quercetin blocked SMMC7721 cells at the G0/G1 phase by FCM analysis. Expression of survivin protein was decreased, and activity of caspase-3 were enhanced. ConclusionQuercetin could induce apoptosis of SMMC7721 cells by down-regcclating the expression of survivin protein and actionting caspase-3.
        Key words： Quercetin；  Hepatic carcinoma cell lines SMMC7721；  Apoptosis;   Survivin；  Caspase-3
        槲皮素（Quercetin, Que, 3,5,7,3",4"-五羟基黄酮）广泛存在于植物界，大约68 %的植物中都含有。槲皮素药理作用广泛，具有降血压、降血脂、扩张冠状动脉、抗血小板聚集、抗炎、抗过敏、抗心律失常和清除自由基等多种生物活性及药理作用［1～5］。近年发现槲皮素不仅对多种致癌剂、促癌剂有拮抗作用，而且可以抑制多种恶性肿瘤细胞的生长［6～10］。Survivin蛋白是新近发现的凋亡抑制因子，在肿瘤的发生发展中具有重要地位。槲皮素对肿瘤细胞中survivin蛋白表达的影响，至今还不十分清楚。因此本课题试图研究survivin表达在槲皮素诱导SMMC7721细胞凋亡中的调节作用，为探讨槲皮素诱导肝癌细胞SMMC7721细胞凋亡的机制提供实验依据。
           1  材料
        RPMI 1640培养液，胎牛血清（Hyclone公司），槲皮素（Sigma公司），Hoechst33258（Sigma公司），免疫组化染色SP试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司），兔抗人survivin多克隆抗体（北京中杉金桥生物技术有限公司），Caspase-3分光光度法检测试剂盒（南京凯基生物科技发展有限公司）。
           2  方法
        2.1  细胞培养人肝癌细胞株SMMC7721，细胞单层接种在含10％胎牛血清的RPMI1640培养液中，在饱和湿度，温度为37℃，CO2浓度为5％的培养箱中培养。
        2.2  细胞生长抑制肝癌细胞SMMC7721，5×104个/ml，接种于96孔培养板，每孔200 μl。培养24 h。更换10%FBS的含药培养基，使槲皮素终浓度为12.5，25，50，100，200 μmol·L-1，每一浓度重复5孔，分别培养24，48，72   h，培养终止前4 h加入MTT（5 mg·L-1）每孔20 μl，37℃孵育。终止时弃上清后每孔加入150 μl二甲基亚砜，振荡混匀10 min，使结晶物充分溶解后，在酶标仪（λ= 490 nm）上测各孔的吸光度（OD）值，重复 3 次，按下式计算细胞生长抑制率：
        肿瘤细胞生长抑制率（IR）=｛1-实验组平均OD值对照组平均OD值｝×100%（以空白组OD值调零）
        2.3  细胞形态学变化观察取对数生长期SMMC7721细胞5×104个，加入放有盖玻片的六孔板内。培养24 h后，更换10%FBS的含药培养基，设空白对照组和加药实验组，使加药组槲皮素终浓度分别达到40，80，160 μmol·L-1，继续培养 48 h后，用PBS洗两次，然后用固定液（甲醇∶冰醋酸=3∶1）固定15 min，用PBS洗两次，37℃Hoechst33258染色液（5 mg·L-1）染色15～30 min，用PBS洗两次，用中性树脂封片，荧光显微镜下观察细胞形态并拍照。镜下随机找到 5个不重复区，计数 200 个细胞中凋亡细胞数，其中凋亡细胞所占百分比即为细胞凋亡率。
        2.4  流式细胞仪(FCM)检测细胞周期以40，80，160 μmol·L-1的槲皮素处理SMMC7721细胞48 h后，收集细胞制成单细胞悬液，0.01 mol·L-1 PBS（pH7.4）洗两次，70%冰乙醇固定过夜，碘化丙啶(PI)染色，流式细胞仪检测，分析细胞周期，以未处理的细胞为对照组。
        2.5  免疫细胞化学法检测survivin蛋白表达取对数生长期肿瘤细胞SMMC7721，2×105个/孔细胞接种于放置有盖玻片的 6 孔板，待自然贴壁后，设加药实验组和空白对照组，实验组加入槲皮素，使槲皮素终浓度分别达到40，120 μmol·L-1。24 h后取出长满细胞的盖玻片置于培养皿中。此细胞爬片用PBS 洗2次，5 min/次。然后按照SP免疫组化检测试剂盒说明书操作。在光镜下确定有代表性的染色阳性 5个视野，随机计数 200个细胞，阳性表达为棕黄色，其中阳性细胞所占百分比即为survivin蛋白表达的阳性率。
        2.6  分光光度法检测caspase-3活性取对数生长期肿瘤细胞SMMC7721，2×105个/孔细胞接种于6 孔板，待自然贴壁后，设加药实验组和空白对照组，实验组加入槲皮素，使槲皮素终浓度分别达到40，120 μmol·L-1。培养24 h后，收集细胞，用PBS洗涤细胞2次（离心2 000 r/min，5 min），弃去PBS上清。按试剂盒步骤检测caspase-3活性。用酶标仪（λ=405 nm）测定其吸光值。
        2.7  统计学处理所得数据以±s表示，数据处理用SPSS11.0统计软件，组间比较采用配对t 检验。
           3  结果
        3.1  槲皮素对SMMC7721细胞的生长抑制作用从表1可以看出，槲皮素对肝癌细胞SMMC7721的生长有明显的抑制作用，且随药物作用时间的延长和药物作用浓度的升高而增强，存在时间依赖性和浓度依赖性。24，48，72 h槲皮素的半数抑制浓度分别为126.22，84.24和55.06 μmol·L-1。表1  槲皮素对肝癌细胞SMMC7721生长的抑制作用与空白对照组比较，*P<0.05, **P<0.01；n=5
        3.2  槲皮素金属配合物诱导SMMC7721细胞凋亡的形态学变化在荧光显微镜下观察，可以看到对照组细胞的细胞核呈规则的椭圆形，核内物质均匀分散。经槲皮素处理48 h后SMMC7721的细胞核明显变小，呈现出不规则的形状，染色体凝聚，有些细胞可以看到染色质聚集在核膜周围，还有一些细胞核发生碎裂成为凋亡小体，这些都是细胞凋亡的典型特征。表明经槲皮素作用的SMMC7721细胞死亡经历了凋亡过程。根据Hoechst33258染色结果计算的细胞凋亡率如图1所示。
        与空白对照组比较，*P<0.05，**P<0.01
        图1  SMMC7721细胞经槲皮素处理48h后的细胞凋亡率（%）3.3  槲皮素对SMMC7721细胞周期的影响SMMC7721细胞48 h后与对照组比较（表2），G0/G1期细胞比例明显增加，S期和G2/M期细胞比例减少，并且药物浓度越高，G0/G1期细胞比例越高。表明槲皮素能阻止SMMC7721细胞由G0/G1期向S期和G2/M期移行，使细胞阻滞于G0/G1期。
        表2  槲皮素对SMMC7721细胞周期的影响
        组别浓度C/μmol·L-1G0/G1(%)S(%)G2/M(%)空白对照048.330.522.2槲皮素4059.420.120.58064.119.616.316069.618.811.6
        3.4   槲皮素对survivin蛋白表达的影响40 μmol·L-1 槲皮素和120 μmol·L-1 作用SMMC7721 细胞24 h后，survivin表达明显降低（图2）。与空白对照组相比，survivin表达率分别降低了32.6%和45.4%。
        3.5  槲皮素对SMMC7721细胞caspase-3酶活性的影响SMMC7721细胞经40 μmol·L-1和 120 μmol·L-1槲皮素处理24 h后，caspase-3的吸光度值分别提高了1.81和2.46倍（图3）。因此槲皮素作用SMMC7721 后caspase-3的活性明显升高，其差异显著。
        与空白对照组比较，*P<0.05，**P<0.01
        图2  SMMC7721细胞经槲皮素处理后的survivin蛋白的表达率（%）
        与空白对照组比较，*P<0.05，**P<0.01
        图3  槲皮素对SMMC7721细胞的caspase-3活性的影响
           4  讨论
        细胞的凋亡与增殖作为生物体内并存的一对矛盾，在正常情况下，两者应该维持动态平衡。细胞增殖、分化、凋亡三者之间的平衡失调与肿瘤的发生、发展密切相关［11，12］。凋亡抑制蛋白IAP（Inhibitors of Apoptosis Protein）是抑制细胞凋亡的重要成分，这一蛋白家族抑制细胞凋亡的作用远远大于bcl-2家族的作用［13］。survivin是新近发现的IAP家族成员，是迄今发现最强的凋亡抑制因子，具有抑制细胞凋亡和促进细胞分裂的双重功能［13～15］。Survivin抗凋亡作用已被研究证实，它不仅通过阻断线粒体细胞色素C释放，与下游凋亡效应因子caspase-3和caspase-7结合而对其活性产生直接抑制效应，还通过与纺缍体纤维的结合，间接抑制caspase对纺缍体的水解作用，有利于保护有丝分裂细胞的完整性，从而抑制细胞凋亡［16］。另外，survivin与细胞周期素/细胞周期素依赖性激酶4(cyclin-dependent kinase 4, CDK4)形成Survivin-CDK4复合体，释放出p21，而p21能进一步与线粒体caspase-3结合，抑制其活性，阻止细胞凋亡［17］。Survivin的表达存在严格的细胞周期特异性，在G2/M期高表达，而在G1期survivin mRNA和蛋白水平快速降低。抑制survivin的表达将促进肿瘤细胞凋亡和阻断肿瘤细胞有丝分裂，这为癌症的治疗提供了一种重要的策略［18，19］。
        本研究结果表明槲皮素对肝癌SMMC7721细胞生长有明显的抑制作用，具有浓度和时间依赖性。同时荧光染色发现经槲皮素处理的SMMC7721细胞核固缩，染色质凝聚，出现了凋亡小体。且细胞周期被阻滞于G0/G1期。经槲皮素处理的肝癌SMMC7721细胞的survivin蛋白表达下降，caspase-3的活性增强。槲皮素阻止SMMC7721细胞由G0/G1期向S期和G2/M期移行，G2/M期细胞随槲皮素浓度增加而减少。因而具有细胞周期依赖性的survivin蛋白表达显著下降，使抑制细胞色素C释放的功能减弱，增加了SMMC7721细胞对药物的敏感性，并引发caspase的级联反应，激活了caspase-3，从而促进了SMMC7721细胞凋亡。    综上所述，Survivin表达的下调可能是槲皮素诱导SMMC7721细胞凋亡的重要机制之一。
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