高效液相色谱法测定木瓜片中欧前胡素的含量
作者:叶挺祥, 刘征辉, 赵洪芝, 刘新元, 李 春, 程 奕, 罗国安
作者单位:1.天津海世达检测技术有限公司,天津; 2. 天津市现代中药质量检验中心,天津 ; 3.天津中新药业集团股份有限公司隆顺榕制药厂,天津
《时珍国医国药》 2008年 第10期
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【摘要】
目的建立木瓜片中欧前胡素的高效液相色谱(HPLC)含量测定方法。方法色谱柱为Agilent Eclipse XDB C18柱(4.6 mm×250 mm, 5 μm);流动相为甲醇-水(59∶41);流速1.0 ml/min;波长248 nm,柱温30℃。结果欧前胡素线性范围为 5.64~56.4 mg(r=0.999 4);平均回收率分别为97.8% (RSD为1.65%)。结论所建定量方法专属性强,重复性好,可为木瓜片的质量控制方法。
【关键词】 木瓜片; 欧前胡素; 高效液相色谱法; 白芷
Determination of Imperatorin in Mugua Tablets by HPLC
YE Tingxiang1,2, LIU Zhenghui1,2, ZHAO Hongzhi1,2, LIU Xinyuan3, LI Chun3, CHENG Yi1,2, LUO Guoan1,2
(1. Tianjin High-stardard Quality Testing Lab, Tianjin 300381, China; 2. Tianjin Center for Quality Testing of TCM, Tianjing 300381, China; 3. Longshunrong Pharmaceutical Factory, Tianjin Zhongxin Pharmaceutical Group Corporation Limited Tianjin 300457, China)
Abstract:ObjectiveTo establish the quality standard for Mugua Tablets. MethodsThe content of Imperatorin was determined by HPLC. The chromatographic column was an Agilent Eclipse XDB C18 (4.6 mm×250 mm, 5 mm), the mobile phase was methanol-water (59∶41), the detection wavelength was 294 nm, the flow rate was 1.0 ml/min, and the column temperature was 30℃. ResultsThe linear ranges of imperatorin were with in the range of 5.54 to 56.4mg (r=0.999 4). The average recovery was 97.8% (RSD was 1.65 %) . ConclusionThe HPLC method is exclusive, reproducible and suitable for the quality control of Mugua Tablets.
Key words:Mugua Tablets; Imperatorin; HPLC; Radix Angelicae Dahuricae
木瓜片收载于部颁药品标准(WS3-B-1890-95),由木瓜、当归、川芎、白芷等12味中药材组成,主要用于风寒湿痹,四肢麻木,周身疼痛,腰膝无力,步履艰难。白芷为本方中的主药之一,所含化学成分以挥发油、香豆素类为主,具有散风除湿,通窍止痛,消肿排脓之功效[1]。现代药理实验表明白芷中所含欧前胡素为其重要活性成分之一,多采用HPLC法测定其含量来控制白芷药材[1~3]及其成药质量[4,5]。本品在原部颁标准中无含量测定方法,因此本实验建立高效液相色谱法测定欧前胡素的含量,可以更有效地控制该成药的质量。
1 器材
Waters 2695高效液相色谱仪,配置自动进样器、2996二极管阵列检测器、柱温箱。甲醇(色谱纯,美国Fisher),超纯水(millipore);其它试剂为分析纯。
欧前胡素对照品(中国药品生物制品检定所,批号为11826-200410)。
木瓜片样品由天津中新药业集团隆顺榕制药厂提供(批号为:060801,060802,060803)。
2 方法与结果
2.1 色谱条件 色谱柱为Agilent Eclipse XDB C18柱(4.6 mm×250 mm, 5 μm);流动相为甲醇-水(59∶41);流速1.0 ml/min;波长248 nm,柱温30℃;进样量10 μl。
2.2 对照品溶液的制备 精密称取欧前胡素对照品7.5 mg,置50 ml量瓶中,用甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀。精密量取1 ml,置50 ml量瓶中,用甲醇稀释至刻度,摇匀,即得(每毫升含欧前胡素3 μg)。
2.3 供试品溶液的制备 取本品适量,研细(过80目筛),取2 g,精密称定,精密加入甲醇25 ml,称定重量,超声处理60 min,放冷,过滤,蒸干,用少量甲醇洗涤容器,合并滤液,蒸干,残渣用甲醇溶解转移至10 ml容量瓶中,用甲醇稀释至刻度,摇匀,过0.45 μm微孔滤膜,即得。
2.4 阴性样品溶液的制备按处方取除白芷外的其他各味药材,按木瓜片的制备工艺制得阴性样品,再按供试品溶液的制备方法,制得阴性样品溶液。
2.5 专属性实验 分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液、阴性样品溶液各10 μl,采用“2.1”项色谱条件注入高效液相色谱仪,HPLC图谱见图1。结果表明处方中其它成分对欧前胡素含量测定无干扰。
2.6 线性范围 精密吸取的欧前胡素(浓度为2.82 μg/ml)对照品溶液2,4,6,8,10,12,20 μl,注入液相色谱仪,按实验色谱条件分析,测定各自峰面积,以对照品进样量(μg)为横坐标,峰面积值为纵坐标,求得回归方程:Y = 5 261.4X - 2 946.9,相关系数r= 0.999 4。结果表明欧前胡素在5.64~56.4 μg范围内与峰面积呈良好的线性关系。
2.7 精密度实验 取同一供试品溶液重复进样6次,欧前胡素的峰面积的RSD为1.01%(n=6)。
2.8 稳定性实验取同一供试品溶液分别在0,2,4,8,16 h进行测定,欧前胡素的峰面积的RSD分别为1.15%,表明样品在16 h内稳定。
2.9 重复性实验 取同一批号样品6份,按供试品溶液制备方法制备,并按“2.1”项色谱条件测定,结果欧前胡素的含量的RSD分别为0.87%。
a-欧前胡素对照品 b-木瓜片样品 c-木瓜片缺白芷阴性样品
图1 HPLC图谱
2.10 加样回收实验 取重复性实验同一批号样品,取1 g(共6份),精密称定,分别加入欧前胡素(0.50 μg/ml)对照品溶液各25 ml,称定重量,再按照供试品溶液制备操作,制成供回收率用供试品溶液,按“2.1”项色谱条件分析,测定样品中含量,计算回收率。结果见表1。表1 欧前胡素加样回收率实验结果
2.11 样品测定取3批样品,按供试品溶液的制备方法制备,分别精密吸取欧前胡素对照品溶液与3批供试品溶液,按“2.1”项色谱条件分析,以外标法计算欧前胡素的含量。结果见表2。表2 含量测定结果
2.12 不同色谱柱及不同仪器对含量测定的影响
2.12.1 不同色谱柱对含量测定的影响取同一批号样品,按供试品溶液制备方法平行制备两份,分别用Agilent Eclipse XDB,Dikma色谱柱,采用Waters 2695高效液相色谱仪,按上述色谱条件分析,测定样品中欧前胡素含量。结果见表3。表3 不同色谱柱对含量测定的影响μg·g-1
2.12.2 不同仪器对含量测定的影响取同一批号样品,按供试品溶液制备方法平行制备两份,用Agilent Eclipse XDB色谱柱,分别采用Waters 600与Waters 2695高效液相色谱仪,按上述色谱条件分析,测定样品中欧前胡素含量。结果见表4。
表4 不同仪器对含量测定的影响μg·g-1
仪器欧前胡素含量12平均值Waters2695 16.4116.4816.44Waters60017.05 17.2117.13
n=2
结果显示,采用相同仪器,不同色谱柱,与采用相同色谱柱,不同仪器对测定对检验结果均无影响。
3 讨论
经二极管阵列检测器190~400 nm扫描,欧前胡素紫外扫描图见图2。由图2可以看出欧前胡素分别在192,217,248 nm和301 nm四个波长有吸收,但考虑到在测定过程中使用甲醇作为流动相,在低波长有紫外吸收,而301 nm响应不如248 nm,因此检测波长选择为248 nm。
图2 欧前胡素紫外扫描图
本实验采用了超声处理的方法,考察了不同提取时间(4,60,75 min) 对含量测定的影响;结果表明,选择超声提取60 min欧前胡素已提取完全。
在色谱系统的选择中,先后试验了甲醇-水(55∶45)、乙腈-水(55∶45)等流动相系统,试验发现,欧前胡素与其它组分峰未能较好地分离。因此在试验其它色谱条件中将水相比例调低并考虑成本问题,最终确定甲醇-水(59∶41)为本实验流动相系统,分离情况较好,峰纯度符合要求。
利用高效液相色谱法测定木瓜片中欧前胡素的含量,所测结果重复性、精密度较好,具有灵敏、准确、快速的特点,有利于药品质量的控制,确保药物的临床疗效。
【参考文献】
[1] 国家药典委员会. 中国药典,Ⅰ部[S].北京:化学工业出版社,2005:69.
[2] 孟兰贞,聂 红,徐珍夏,等. 色谱技术在中药白芷研究中的应用进展[J].时珍国医国药, 2006,17(1):4.
[3] 贾敏如, 王梦月, 金曲嫫, 等. HPLC测定13种白芷中欧前胡素和异欧前胡素的含量[J].华西药学杂志, 2003,18(5):361.
[4] 毛彦杰, 岳 敏, 谷学新, 等. HPLC测定清眩丸中欧前胡素的含量[J].中成药, 2005,27(5):618.
[5] 赵春香, 梁 英, 王丽娜. HPLC法测定鼻炎灵片中欧前胡素的含量[J].中草药, 2004,35(6):642.