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       【摘要】 
       目的从复方二精灵中分离多糖并研究其结构。方法以黄精和枸杞子为材料，经热水提取、乙醇沉淀得二精灵多糖，通过二乙氨基乙基纤维素柱、凝胶渗透柱层析分离纯化，并采用高效液相色谱、红外吸收光谱、气相色谱进行结构分析。结果得两个多糖组分2JLⅠ和2JL Ⅱ，2JLⅠ主要是由阿拉伯糖、木糖、半乳糖、甘露糖和葡萄糖组成，相对分子量为811000；2JLⅡ由半乳糖、葡萄糖和甘露糖组成，相对分子量为2000。结论首次从复方二精灵中提取分离出两种纯多糖，该实验方法为以后二精灵多糖的研究提供了基础。
       【关键词】  目的从复方二精灵中分离多糖并研究其结构。方法以黄精和枸杞子为材料，经热水提取、乙醇沉淀得二精灵多糖，通过二乙氨基乙基纤维素柱、凝胶渗透柱层析分离纯化，并采用高效液相色谱、红外吸收光谱、气相色谱进行结构分析。结果得两个多糖组分2JLⅠ和2JL Ⅱ，2JLⅠ主要是由阿拉伯糖、木糖、半乳糖、甘露糖和葡萄糖组成，相对分子量为811000；2JLⅡ由半乳糖、葡萄糖和甘露糖组成，相对分子量为2000。结论首次从复方二精灵中提取分离出两种纯多糖，该实验方法为以后二精灵多糖的研究提供了基础。
       Separation,Purification and Structural Elementary Studies of Polysaccharide from Compound Erjingling
        CHENG Yujie，XU Lingling，MEI Zhinan*
        (Institute of Ethomedicine, South-central University for Nationalities, Wuhan, 430074, China)
        Abstract:ObjectiveThe polysaccharides were separated from compound Erjingling and its structures were studied.MethodsThe Compound Erjingling polysaccharides was extracted from Rhizome of Polygonatum Kingiarnum and Fructus Lycii,by hot water extraction,ethanol precipitation isolated, purified through DEAE-cellulose,gel permeation column chromatography and the structures were analyzed by HPLC,IR and GC.ResultsTwo polysaccharide components 2JLⅠ and 2JLⅡwere obtained,2JLⅠ was mainly composed of arabinose, xylose, galactose, mannose and glucose, and its relative molecular weight was 811000. 2JLⅡwas composed of galactose, glucose and mannose, and its relative molecular weight was 2000.ConclusionIt was the first time to extract and isolate two kinds of pure polysaccharide from compound Erjingling, and the experimental methods provid foundation for the research of Compound Erjingling polysaccharide afterward.
        Key words:Compound Erjingling;   Polysaccharide;  HPLC;  IR;  GC
        复方二精灵是由等量的枸杞子 Fructus Lycii和黄精Rhizome of Polygonatum Kingiarnum 配伍组成。最早收载于《圣济总录》，具有“助气固精,补填丹田,活血驻颜,长生不老”之功效［1］。本课题组前期研究发现，复方二精灵多糖可显著抑制急性分离的海马神经元电压门控性钠通道电流峰值,使钠通道半激活电压向去极化方向偏移，有效阻止了海马细胞内钙积聚，在一定程度上减弱了海马细胞内钙超载所致海马细胞损伤，并可能通过阻断兴奋性谷氨酸受体，调节Bcl-2、Bax蛋白的表达，有效的阻止Glu诱导的海马神经元凋亡［2］。为了研究其作用机理，本课题组对复方二精灵多糖进行了分离纯化，并对其结构进行了初步研究。
        1  材料与仪器
        1.1  药材与试剂滇黄精，云南产；宁夏枸杞，宁夏产；DEAE-52、SephadexG-200、CM SephadexC-50，Pharmacia进口分装；透析袋，截留分子量为1000；苯酚经过重蒸，其它试剂均为国产分析纯。
        1.2  仪器Agilent6890N气相色谱仪（Agilent）；HP-5石英毛细管柱；WFZ UV-2000紫外可见分光光度计（尤尼柯仪器有限公司）；Agilent 1100高效液相色谱仪(RID检测器、自动进样器)（Agilent）；色谱柱：Aqueous GPC Start Up Kit  300 mm×7.5 mm（Agilent）；GPC色谱工作站（ Agilent）；NEXUS 470智能型傅立叶红外光谱仪（美国尼高力公司）。
           2  方法
        2.1  二精灵多糖的提取和分离纯化根据文献报道的方法进行提取，并采用硫酸-苯酚法于490 nm测定复方二精灵粗多糖的糖含量并计算得率［3,4］。取粗多糖0.2 g用10 ml蒸馏水溶解后，上 DEAE-52（OH-）纤维素柱（1.6 cm×40 cm）进行分离，依次用蒸馏水、0.05～0.5 mol/L的NaCl、0.1 mol/L的NaOH梯度洗脱，分步收集，硫酸-苯酚法检测，将含糖主峰合并收集，冷冻干燥得6个多糖组分。取多糖组分Ⅰ和组分Ⅱ再依次用SephadexG-200、CM-SephadexC-50柱层析进一步分离纯化，蒸馏水洗脱，分别收集含糖主峰并冷冻干燥得二精灵Ⅰ（2JLⅠ）和二精灵Ⅱ（2JLⅡ）。
        2.2  多糖各组分的纯度鉴定和分子量测定取2JLⅠ、2JLⅡ适量，用少量水溶解后，上高效液相色谱进行分析。根据所得图谱判断样品的纯度。各取分子量对照品和2JLⅠ、2JLⅡ适量，用少量水溶解后，上高效液相色谱检测，通过GPC色谱工作站自动计算，得各样品的相对分子量（Mn）。色谱条件：流动相 纯水；流速1.0 ml/min；柱温25℃。
        2.3  红外吸收光谱分析分别取2JLⅠ、2JLⅡ各2～3 mg，采用KBr压片，400～4000 cm-1扫描得各样品图谱并分析。
        2.4  多糖的单糖组成分析［4］
        2.4.1  样品和混合标准单糖的水解 准确称取2JLⅠ 2.5 mg，2JLⅡ1.5 mg，标准单糖各3 mg于3个具塞试管中，以4 ml 3 mol/L三氟乙酸（TFA）溶解，封管，置于沸水浴中水解6 h，冷却后于40℃减压蒸干，加入3 ml甲醇并蒸干，反复4次以除去剩余的TFA，40℃真空干燥过夜。
        2.4.2  样品和混合标准单糖衍生物的制备取出已水解并干燥的样品和混合标准单糖，以2 ml吡啶溶解，加入0.8 ml六甲基二硅胺烷和0.4ml三甲基氯硅烷，混匀后室温放置15 min，于冰水浴中加入2 ml蒸馏水，混匀后，静置分层，分别取2JLⅠ 1 μl，2JLⅡ5 μl进样分析。气相色谱条件：载气N2，流速1.5 ml/min，进样口温度230℃，检测器温度230℃，柱温采用程序升温方式，初始温度145℃，持续14 min，然后以10℃/min升温，终温为180℃，持续10 min.空气流速：500 ml/min，氢气流速50 ml/min，氮气流速20 ml/min。
        3  结果
        3.1  粗多糖的提取和分离纯化复方二精灵粗多糖为白色粉末状物质，重4.182 g，经硫酸-苯酚法测定其糖含量为87.25%，得率为8.36%。粗多糖经过DEAE-52（OH-）纤维素柱的初步分离，得到6个组分（见图1）。取组分Ⅰ和组分Ⅱ依次再用凝胶渗透柱层析进行分离纯化，冷冻干燥得2JLⅠ和2JLⅡ，都为白色絮状物质。实验证明2JLⅠ,2JLⅡ易溶于水，不易溶于丙酮，无水乙醇、石油醚等有机溶剂。硫酸-苯酚、硫酸-蒽酮反应呈阳性，说明这两个组分为糖类物质。
        图1  DEAE纤维素（OH-）柱层析分离图谱
        3.2   多糖各组分的纯度鉴定和分子量测定经HPLC分析得2JLⅠ、2JLⅠⅠ经过纯化后都为单一峰（见图2～3），表明2JLⅠ、2JLⅡ为较纯且单一的组分。根据对照品的分子量与保留时间（见图4），通过GPC色谱工作站自动计算得2JLⅠ 的相对分子量（Mn）为811000，2JLⅡ的相对分子量（Mn）为2000。
        图2  二精灵多糖Ⅰ的HPLC图谱     图3  二精灵多糖Ⅱ的HPLC图谱          
        分子量分别为：442300 (RT：6.517min)；20340 (RT：7.797min)；
        1844 (RT：8.857min)    106 (RT：9.629min)
        图4  标准分子量对照品HPLC图谱
        3.3  红外光谱分析从IR图谱（见图5～6）分析可见，2JLⅠ、2JLⅡ都具有以下几组多糖类物质的特征吸收峰： 3600～3200 cm-1为糖分子中羟基的伸缩振动形成的宽而强的峰；3000～2800 cm-1为C-H伸缩振动的吸收峰是糖类的特征吸收峰；在1643 cm-1和1409 cm-1的吸收峰属酰胺Ⅰ带和Ⅲ带，表明多糖中存在酰胺基；1250～950 cm-1间的吸收峰为C-O伸缩振动的吸收峰，是糖环的醚键（C-O-C）和羟基的吸收峰，表明存在糖环内醚结构。2JLⅠ在 835 cm-1的吸收峰是吡喃环的α-端基差向异构的C-H变角振动，表明2JLⅠ结构中含α构型的吡喃糖苷键。2JLⅡ在936 cm-1是呋喃环对称伸缩振动的吸收峰；823 cm-1是呋喃环的α-型C-H变角振动的吸收峰，表明2JLⅡ结构中含α构型的呋喃糖苷键。
        图5  2JLⅠ的红外光谱
        图6  2JLⅡ的红外光谱
        3.4  多糖的单糖组成2JLⅠ、2JLⅡ和混合标准单糖的水解产物经过三甲基硅醚化后气相分析（结果见图7～9）。分析得到2JLⅠ主要由阿拉伯糖、木糖、半乳糖、甘露糖和葡萄糖；2JLⅡ由半乳糖、葡萄糖和甘露糖组成。
           4  讨论
        本实验采用DEAE-52(OH-)纤维素、SephadexG-200、CM-SephadexC-50分离纯化的方法，每管溶液都要用硫酸-苯酚法于490nm进行检测，因为多糖本身是不具有紫外吸收的特性，所以在检测的过程中容易产生误差。但该方法上样量大，可用不同溶剂的不同浓度进行梯度洗脱，还可以根据需要更换不同的柱型和填料，能分离多种多糖组分且得到各组分的量较多，如果在检测过程中操作规范也可以减小误差，适用于实验室的小批量生产和各种分析实验。根据文献报道也有用HPLC法进行分离和纯化，但与前面的方法相比进样量小，不可更换填料，只能采用示差检测，且平衡时需时较长，一般只用于经过凝胶渗透柱层析后还不能使各组分分离的样品。
        用高效液相色谱检测各组分的纯度和分子量的测定，采用示差检测器，可直接根据图谱工作站显示的图谱进行分析，而且还可以使用GPC色谱工作站根据标准分子量自动计算出样品的相对分子量，与用SphadexG-200或SDS-PAGE检测纯度和测定分子量相比该法简便、直观、误差较小。
        多糖的单糖组成分析本实验采用三氟乙酸水解，三甲基硅醚化衍生后气相分析，相对于文献报道中的糖醇乙酰化衍生法该法虽然容易产生异构峰，但操作简便、快捷，且对于多糖的单糖组成分析没有太大的影响，适用于结晶糖样和组分简单糖样的测定。
        这是首次从复方二精灵中提取分离出的两种纯多糖，其生物活性及其它结构正在研究之中，但该实验和方法为以后二精灵多糖的研究提供了基础。
       【参考文献】
         ［1］ 尹世金，刘向明，吴群绒，等.复方二精灵多糖抗脑缺血缺氧损伤的分子机理［J］.时珍国医国药,2005,16(11):1170.
       
       ［2］ 徐玲玲，程玉洁，李 劲，等.复方二精灵多糖对谷氨酸诱导的海马神经元凋亡的保护作用［J］.中国药理学与毒理学杂志，2008，22（2）：124.
       
       ［3］ 吴群绒，胡 盛，杨光忠，等.滇黄精多糖Ⅰ的分离纯化及结构研究［J］.林产化学与工业,2005,25(2)：80.
       
       ［4］ 张惟杰.糖复合物生化研究技术，第2版［M］.杭州：浙江大学出版社，1999：36.