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       【摘要】 
       目的探讨金边瑞香对荷S180瘤小鼠免疫功能的影响。方法MTT比色法测定小鼠T淋巴细胞增殖反应；鸡红细胞吞噬实验检测小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能，红细胞C3b受体花环（RBC- C3bRR）法检测小鼠红细胞免疫功能。结果20 g/（kg·d），40 g/（kg·d）金边瑞香能提高荷S180瘤小鼠的T淋巴细胞增殖刺激指数、腹腔巨噬细胞的吞噬率和吞噬指数，20 g/（kg·d）金边瑞香可提高荷S180瘤小鼠的红细胞C3b受体花环结合率。结论金边瑞香对荷S180瘤小鼠的细胞免疫、非特异性免疫、红细胞免疫功能均有不同程度的促进作用。
       【关键词】  金边瑞香； 荷瘤小鼠； 免疫功能
       金边瑞香Daphne odora var. marginata是我国传统名花［1］，以其色、香、姿、韵四绝而具有较高的观赏价值，此外金边瑞香还具有可观的药用价值。金边瑞香含有瑞香苷，水解生成瑞香素，其根、茎、叶、花均可入药，性甘无毒，具有清热降火、消炎去肿、活血化淤、散结止痛之功能。据《中药大辞典》汇辑，瑞香叶能治疮疡、风痛；花可治咽喉牙齿肿痛；根茎能治毒蛇咬伤、跌打损伤等疾病。近年来对金边瑞香的研究及开发逐渐增多。研究表明金边瑞香具有抗炎症［2］、抑菌、抗脂质过氧化、抗衰老［3］和对正常小鼠的细胞免疫、非特异性免疫、红细胞免疫功能有促进等作用［4，5］，而对荷瘤小鼠免疫功能方面的影响尚未见报道。本实验研究了金边瑞香对荷S180瘤小鼠免疫细胞功能的影响，以利于进一步开发应用。
        1   材料
        腹水型肉瘤S180小鼠，由赣南医学院分析实验室李舒梅教授惠赠；健康昆明种小鼠，由南昌大学医学院实验动物科学部提供，雌雄兼用，6～8周龄，体重18～22g，分笼饲养，自由饮水及进食。金边瑞香浸膏，由江西省中医药研究院熊学敏教授提供，含生药量5g/ml，临用时用蒸馏水配制成所需浓度；RPMI1640, GIBCO公司产品；刀豆蛋白A(ConA)，SIGMA公司产品；小牛血清，杭州四季青生物工程材料有限公司产品；四甲基偶氮唑盐(MTT), AMERSCO公司产品；环磷酰胺，江苏恒瑞医药股份有限公司产品；酵母菌，广东丹宝酵母有限公司产品。
           2  方法
        2.1  荷瘤小鼠模型建立无菌条件下取传代7～9d生长良好的S180小鼠腹水，用生理盐水按1∶4稀释成细胞悬液（细胞数为4×107/ml），每只小鼠右腋皮下接种0.2ml，24h后随机分组。
        2.2  动物分组及给药实验小鼠随机分为6组，单纯荷瘤模型组给予生理盐水简称生理盐水组；实验组金边瑞香设低、中、高3个剂量组［剂量分别为20，40，80 g/（kg·d）］，灌胃给药1次/d，0.4 ml/次，连续给药10 d；环磷酰胺阳性对照组分别于第1，5，9天腹腔注射CTX（环磷酰胺）100 mg/kg；设未荷瘤小鼠作正常对照组，进行以下实验。
        2.3  金边瑞香浸膏对荷S180瘤小鼠淋巴细胞增殖的影响 停药次日处死小鼠，无菌取脾脏，制成3×106/ml的脾细胞悬液，96孔板培养细胞，每个小鼠脾细胞分别设立对照孔和实验孔，均做3个复孔。每孔加脾细胞悬液100 μl，细胞数为3×105 ，然后实验孔加ConA，使其终浓度为4 μg/ml，对照孔则加RPMI1640培养液。37℃,5% CO2，饱和湿度下培养48 h，加人MTT使终浓度为0.5 mg/m1，继续培养4h吸去上清100 μl，加人DMSO100μl每孔，稍振荡10 min酶标仪490波长测每孔A值。计算刺激指数(SI)SI=实验孔A均值/对照孔A均值。
        2.4    金边瑞香浸膏对荷S180瘤小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响灌胃第10天，每只小鼠腹腔注射2%淀粉生理盐水溶液1 ml，次日，每鼠腹腔注射1%鸡红细胞悬液lm1,1 h后颈椎脱臼处死小鼠。用1.5 ml生理盐水冲洗腹腔，取腹腔洗液0.5 ml滴片，干燥后甲醇固定，瑞氏染液染色。油镜下计数100个巨噬细胞中吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数和吞噬的鸡红细胞总数，计算吞噬百分率和吞噬指数。吞噬百分率（%）=100个巨噬细胞中吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数/100个巨噬细胞×100%；吞噬指数=100个巨噬细胞中吞噬的鸡红细胞总数/100个巨噬细胞。
        2.5  金边瑞香浸膏对荷S180瘤小鼠红细胞免疫功能的影响停药次日，小鼠眼眶取血，RBC经生理盐水洗涤3次，调整浓度为1.25×107/ml红细胞悬液；酵母菌细胞浓度调整为1×108/ml，加等量血清致敏，用生理盐水洗涤1次，恢复原浓度，制成补体致敏酵母菌悬液。取红细胞悬液50 μl、致敏酵母菌悬液50 μl混匀，置37℃水浴30 min，加0.25%戊二醛50 μl，轻轻摇匀。取50 μl涂片，凉干，瑞氏染液染色。油镜下计数200个红细胞，算出RBC-C3b受体花环率。RBC-C3bRR（%）=200个RBC中阳性花环数/200个RBC×100%
        2.6  统计学方法采用单因素方差分析，有统计学意义再行SNK法两两比较。采用SPSS11.5软件统计。
        3  结果
        3.1    金边瑞香浸膏对荷S180瘤小鼠T淋巴细胞增殖的影响    各组用ConA诱导的T淋巴细胞增殖的刺激指数（SI）结果见表1。表1  金边瑞香浸膏对荷S180瘤小鼠T淋巴细胞增殖的影响与生理盐水组比较，**P<0.01；与正常对照组比较，△△P<0.01，▲P>0.05；n=9
        由表1可见，金边瑞香各剂量组与生理盐水组相比，ConA对小鼠脾脏淋巴细胞的刺激指数均有增高，其中40 g/（kg·d）中剂量和20 g/（kg·d）低剂量金边瑞香组增高明显（P<0.01）。生理盐水组和环磷酰胺组与正常对照组比较，对ConA诱导的T淋巴细胞增殖的刺激指数均较低，差异有显著性（P<0.01）。
        3.2  金边瑞香浸膏对荷S180瘤小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响    各组吞噬率和吞噬指数的结果见表2。表2  金边瑞香浸膏对荷S180瘤小鼠巨噬细胞吞噬功能的影响 由表2可见，金边瑞香各剂量组与生理盐水对照组比较，小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬率和吞噬指数均有增高，其中40g/（kg·d）中剂量金边瑞香组增高明显（P<0.05）和20g/（kg·d）低剂量金边瑞香组增高明显（P<0.01）。生理盐水组和环磷酰胺组与正常对照组相比，小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬率和吞噬指数均有降低，差异有显著性（P<0.01）。高剂量组与正常对照组相比，小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬率和吞噬指数均有降低，差异有显著性（P<0.05）。低剂量组与正常对照组相比，小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬率增高，差异有显著性（P<0.05）。
        3.3   金边瑞香浸膏对荷瘤小鼠红细胞免疫功能的影响各组红细胞C3b受体花环率的结果见表3。
        由表2可见，金边瑞香浸膏各剂量组的红细胞C3b受体花环率与生理盐水对照组相比均有增高趋势，其中20 g/（kg·d）低剂量金边瑞香组与生理盐水对照组之间的红细胞C3b受体花环率差异有显著性（P<0.05）。生理盐水组和环磷酰胺组与正常对照组相比，红细胞C3b受体花环率明显降低，差异有显著性（P<0.01），低剂量组与正常对照组比，红细胞C3b受体花环率差异无显著性（P>0.05）。表3  金边瑞香浸膏对荷S180瘤小鼠RBC-C3b受体花环形成的影响与生理盐水组比较，*P<0.05，**P<0.01；与正常对照组比较，△△P<0.01，▲P>0.05；n=9
           4  讨论
        自20世纪70年代初，瑞香科瑞香属植物便成了植物化学和药学研究的一个热点［6］。金边瑞香作为我国名贵花卉之一，近年来对金边瑞香的研究及开发逐渐增多。
        肿瘤的发生发展与机体的免疫功能密切相关，免疫功能受损，导致机体易患肿瘤，而当宿主免疫功能恢复和提高时，就能有效地排斥肿瘤，控制肿瘤的生长和转移。因此，正确评价荷瘤机体的免疫功能，研究中药对机体免疫功能的影响是研究中药抗肿瘤的一个重要方面。脾是体内最大最活跃的免疫器官，脾细胞的淋巴细胞转化功能是反映机体T细胞免疫功能的重要指标。T淋巴细胞在机体抗肿瘤的特异性免疫应答过程中处于关键地位。测定淋巴细胞体外增殖反应是检测细胞免疫功能的常用方法。ConA为最常用的T细胞丝裂原，可引起非特异的淋巴细胞转化［7］。单核巨噬细胞系统是机体非特异性免疫的重要组成部分，也是参与细胞免疫的重要细胞，活化的巨噬细胞可以直接杀伤肿瘤细胞，而且可以释放一些细胞因子和效应分子来发挥多种生物学作用，通过测定巨噬细胞对鸡红细胞的吞噬率和吞噬指数可以反映其吞噬功能的强弱［8］。近年来研究表明，红细胞在抗肿瘤免疫反应中具有很多作用。作为血循环中数量巨大的天然免疫细胞，红细胞 CR 在补体系统及其他天然免疫物质协同作用下，对血循环中的癌细胞会发生快速天然免疫。近年还发现肿瘤细胞可通过旁路途径激活补体，被红细胞CR1免疫粘附，可见红细胞在阻止恶性肿瘤细胞的增殖、转移过程中有一定的作用［9］。
        本实验结果表明，20～40 g/（kg·d）金边瑞香能提高荷S180瘤小鼠的T淋巴细胞增殖刺激指数、腹腔巨噬细胞的吞噬率和吞噬指数，20 g/（kg·d）金边瑞香提高荷S180瘤小鼠的红细胞C3b受体花环结合率，说明金边瑞香能明显增强荷S180瘤小鼠的细胞免疫、非特异性免疫、红细胞免疫功能，以20 g/（kg·d）小剂量金边瑞香效果更好。环磷酰胺与正常对照组相比，环磷酰胺抑制ConA诱导的T淋巴细胞增殖功能，抑制小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬功能，也抑制红细胞免疫功能。
       【参考文献】
         ［1］ 熊学敏,方裕华,曹 珏.金边瑞香鲜花中瑞香素的超临界萃取及条件的优化［J］.中国新药杂志,2003,12(7) :534.
       
       ［2］ 叶和杨,曾 靖,杨敬格,等.金边瑞香的抗炎症作用［J］.赣南医学院学报,2002, 22(l):7.
       
       ［3］ 叶和杨,周 俐,曾 靖,等.金边瑞香对小鼠SOD活性及MDA含量的影响［J］.赣南医学院学报,2003,23(3):246.
       
       ［4］ 徐 静,傅颖媛.金边瑞香对小鼠免疫细胞的影响［J］.广东医学,2005,26（9）:1207.
       
       ［5］ 徐 静,傅颖媛.金边瑞香对小鼠免疫功能影响的量效关系［J］.中国临床康复,2005,9（43）:103.
       
       ［6］ 莫建初,程家安.瑞香属植物生物活性研究进展［J］.天然产物研究与开发,2003, 15(2):167.
       
       ［7］ 杨铁虹,卢保华,贾 敏,等.当归多糖对小鼠免疫功能的影响［J］.中国药理学通报,2003,19(4):448.
       
       ［8］ 周茂文,姚艳辉,肖鸿敏.首祀补肾口服液对小鼠免疫功能的影响［J］.中药材,2003,26(8):575.
       
       ［9］ 唐建国,薛张纲.红细胞免疫系统研究进展［J］.中国临床医学,2002,9（5）:593.