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       【摘要】 
       目的研究忍冬藤叶中的绿原酸分离纯化工艺。方法用静态吸附法考察不同大孔树脂的吸附、解吸性能，并以绿原酸保留率为指标，采用L9(34)正交实验设计对忍冬藤叶中绿原酸的分离纯化工艺条件进行优化。结果综合考虑，最佳大孔树脂为LSA-21，溶媒浓度为25％，溶媒为2BV，洗脱流速为0.6BV·h-1。结论该工艺合理，稳定可行，可用于工业化推广。
       【关键词】  忍冬藤叶； 分离纯化工艺； 大孔吸附树脂； 正交实验设计； 绿原酸
       Study on Purification of Chlorogenic Acids in Twig and Leaf of Lonicera Japonica Thunb.
        YU Jing，WANG Xiaoping，XU Qiang
        (Jiang xi College of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou,344000，China)
        Abstract：ObjectiveTo study the purification of Chlorogenic acid in twig and leaf Lonicera Japonica Thunb. MethodsThe different macroporous resin properties of absorption and desorption were observed by static absorption method. With the reservation rate of chlorogenic acid as indexes．orthogonal design with L9(34) was used to select the condition of purification. ResultsThe macroporous resin of LSA-21 had the best performance,and the optimum conditions as follows：25％ alcohol and 2 BV amount of solution，the flow rate was 0.6 BV·h-1.ConclusionThe condition of purification is stable and practicable, it can be used for the preparation in large scale．
        Key words：Lonicera japonica Thunb.；  Purification;  Macroporous resin；  Orthogonal design;  Chlorogenic acid
        绿原酸是植物在有氧呼吸过程中经莽草酸途径形成的一种苯丙素类化合物，属酚酸类化合物，具有抗菌、抗病毒、升高白细胞、保肝利胆、抗肿瘤、降血压、降血脂等作用［1］，是金银花、忍冬藤叶的主要有效成分之一。因以金银花为原料提取绿原酸的生产成本较高，而与花同株的忍冬藤叶中绿原酸含量与花相近，所以从忍冬藤叶中提取分离绿原酸具有显著经济意义。本实验在研究忍冬藤叶中绿原酸提取工艺的基础上对分离纯化工艺进行优选。
        1  仪器与材料
        1.1  仪器 岛津LC-10ATvp高效液相色谱仪（岛津公司）；N2000色谱数据工作站（浙江大学智能信息工程研究所）；DZF-6021型真空干燥箱（上海一恒）；METTLER-TOLEDD  AB265-S型 电子分析天平(瑞士)。
        1.2  材料     忍冬藤叶，批号070822，江西中医药高等专科学校附属中药饮片厂提供；AB-8，HPD-100A，HPD-400A，HPD-826A，LSA-21，LSA-80等大孔吸附树脂，分别购自天津大学化工厂，沧州宝恩化工有限公司，西安蓝深有限公司；绿原酸对照品，批号110753-200212，购自中国药品生物制品检定所；试剂除HPLC用乙腈为色谱纯外，其他均为分析纯。
           2  方法与结果
        2.1  含量测定
        2.1.1  色谱条件［2］    色谱柱为hypersil ODS2柱（5μm，4.6 mm×250 mm;大连依利特）；柱温35℃；流动相为乙腈-0.4％磷酸（13∶87）；检测波长327 nm；流速1.0 ml·min-1；理论塔板数按绿原酸峰计算应不低于1 000。
        2.1.2  对照品溶液的制备     精密称取绿原酸对照品17.80 mg，置25 ml 棕色量瓶中，加50%甲醇溶液溶解并稀释至刻度，摇匀；精密量取1 ml ，置10 ml 棕色量瓶中加50%甲醇稀释至刻度，摇匀，贮存于棕色量瓶并置4℃冰箱，备用。
        2.1.3  标准曲线的绘制     分别精密量取绿原酸对照品溶液1，2，3，4，5，6 ml置10 ml容量瓶中，加50％甲醇稀释至刻度，依次精密吸取20 μl注入液相色谱仪，记录色谱图。以进样量（X）对峰面积A作线性回归，回归方程为：A=1.565 9×106X+8 319.3,r=0.999 9，可知绿原酸在0.223 6～1.341 6 μg范围内与峰面积呈良好线性关系。
        2.1.4  原药材含量测定     取样品适量，粉碎成粗粉，分别称取3份各0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50％甲醇50 ml，称定重量，超声30 min，放冷，再称定重量，用50％甲醇补足减失重量，摇匀，0.45 μm微孔滤膜滤过，精密吸取对照品溶液与样品滤液各20 μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。用外标法，以峰面积计算样品中绿原酸的含量，结果平均含量按质量分数计为18.40 mg·g-1。
        2.2  上柱前样品溶液的制备      取忍冬藤叶粗粉1 kg，以流速为12 ml·kg-1·min-1，溶媒为40％乙醇渗漉，收得8倍量渗漉液,回收乙醇，精密测定残留液体积并依法测定绿原酸含量，备用。
        2.3  不同型号的大孔吸附树脂对绿原酸吸附、解吸能力的比较称取10 g预处理好的大孔吸附树脂置于100 ml锥形瓶中，加入一定量提取液，浸渍24 h，不时振摇，依法测定含量，并根据公式(1)［3］计算吸附量及吸附率。在吸附饱和的10 g树脂中，加入50 ml 90%乙醇，不断振摇，依法测定含量，根据公式(2)［3］计算解吸量和解吸率。结果见表1。
        Qa＝(Co-Ce) ×V/W  Ea＝(Co-Ce)/Co×100%(1)
        Qd＝Cd×V/W  Ed＝Qd/Qa×100%(2)
        式中：Qa-吸附量(mg·ml-1)；C0-吸附液起始浓度(mg·ml-1)；Ce-吸附液平衡浓度(mg·ml-1)；V-溶液体积(ml )；W-树脂重量(g)；Ea-吸附率（％）；Cd-解吸液平衡浓度(mg·ml-1)；Qd一解吸量(mg·ml-1；Ed-解吸率（％）表1  大孔吸附树脂对绿源酸吸附、解吸附能力比较结果表明，LSA-21吸附量与解吸量最大，LSA-80与HPD-100A吸附量也较大，但解吸量稍低于LSA-21，以吸附量和解吸量为参考指标，综合考虑最佳大孔吸附树脂为LSA-21。
        2.4  优化分离纯化工艺参数
        2.4.1  正交实验设计为优化分离、纯化工艺参数，在预实验的基础上，采用L9（34）正交实验设计，以绿原酸保留率为指标，考察乙醇浓度、收集量、洗脱流速对LSA-21分离、纯化效果的影响。因素与水平见表2。
        表2  因素水平
        水平A乙醇浓度（%)B收集量/BVC洗脱流速/BV·h-112510.4 23520.634530.8
        2.4.2  实验安排及结果取已处理好的大孔树脂装柱，依生产企业实际生产情况，固定大孔吸附树脂柱径高比为1∶4。分别取忍冬藤叶渗漉液9份各80 ml，上样，均先用1 BV蒸馏水洗脱，固定水洗脱流速0.8 BV·h-1，水洗脱液另存；然后依L9（34）正交实验设计安排表进行实验，收集醇洗脱液，摇匀，精确测定体积，依法测定绿原酸含量并计算保留率（％）。结果见表3，方差分析见表4。
        由表3～4可知，对绿原酸保留率的影响因素依次是B＞C＞A，其中因素B有显著性影响，最佳工艺条件为A3B3C2。考虑到A1与A3、B2与B3水平对绿原酸保留率影响相近，本着降低成本的原则，确定优化工艺为A1B2C2，即溶媒为25％乙醇，收集洗脱液2 BV，洗脱流速为0.6 BV·h-1。 表3  正交实验安排及结果表4   正交实验方差分析
        2.5  验证实验  为进一步考察上述最佳工艺的稳定性和合理性，按该工艺条件进行重复性实验3次，依法测定绿原酸含量并计算保留率。结果见表5。实验结果表明该工艺重复性好，且稳定可行。表5  最佳工艺的验证实验%
           3  讨论
        曾比较水提石灰乳沉淀法、乙醇回流法、乙醇渗漉法等3种提取方法对忍冬藤叶中绿原酸提取率的影响，结果表明乙醇渗漉法为最佳，并经L9（34）正交实验优化提取工艺条件为： 以40％乙醇为溶媒，收集8倍量渗漉液，流速为12 ml·kg-1·min-1。
        在提取液上柱吸附平衡后，经实验确定水洗脱流速0.8 BV·h-1。同时进行了3 BV蒸馏水洗脱实验，每1 BV收集1份，共3份。实验结果表明，第1份水洗脱液中含有少量绿原酸，而第2，3份水洗脱液中几乎不含绿原酸；将3份水洗脱液分别干燥，得浸出物，称重，结果除第1份中浸膏收率较大外，第2，3份水洗脱液中浸膏收率均很低。因此，确定先用1 BV蒸馏水洗脱，再依实验安排用不同浓度乙醇洗脱。
        经对上柱醇洗脱液进行浓缩，干燥，称重并依法测定含量，结果干膏收率为5.03％，绿原酸平均含量按质量分数计为28.54％，计算绿原酸总保留率为78.01％。依企业实际要求，我们在上述提取分离工艺条件的基础上，又进行了第2步分离纯化工艺研究，最终实验结果是干膏收率1.87％，绿原酸含量按质量分数计为65.26％，计算绿原酸总保留率为66.32％。
       【参考文献】
         ［1］ 杜延兵，裘爱泳. 绿原酸生物活性、资源及其提取纯［J］.现代食品科技,2006, 22(2)：250.
       
       ［2］ 国家药典委员会.中国药典，Ⅰ部［S］.北京：化学工业出版社，2005：152，153.
       
       ［3］ 王 芳，刘晓华，赵浩如. 大孔吸附树脂对绿原酸吸附性能的研究［J］.海峡药学，2006，18（1）：97.