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       【摘要】 
       目的检测苜蓿中总黄酮的含量，并研究其提取工艺。方法通过加热回流、索氏提取、超声提取3种工艺比较，确定采用超声提取。以总黄酮含量为考察指标，采用正交实验法优化超声提取的工艺条件。结果所考察因素中，苜蓿的提取工艺各因素影响程度为：料液比＞提取次数＞提取时间＞乙醇浓度，最佳水平搭配为A3B2C1D1。结论苜蓿总黄酮最佳提取工艺参数为：超声法提取，60%乙醇，30∶1的液固比，提取3次，1 h/次。苜蓿全草中含有总黄酮3.75%，苜蓿叶子中含有总黄酮4.85%。
       【关键词】  苜蓿； 总黄酮； 正交实验
       Study on the Extraction Technology and Determination of Flavones in Alfalfa
        FENG Tao,   BIAN Ruihuan, TANG Ranxiao,  LIU Haiyan,  WU Qiuhua*,  JI Shujing, LIU Shujing
        （College of Sciences, Agricultural University of Hebei, Baoding 071001，China）
        Abstract：ObjectiveTo determine the content of flavonoids and study the extraction of Alfalfa.MethodsBased on comparison of 3 kinds of heating reflux, Soxhlet" s extractor, ultrasonic extraction,with total flavonoids as index. the parameters of ultrasonic extraction on the basis of flavonoids were performed and comfirmed by orthogonal design. Results The order of factors which affected the flavonoid extraction was ratio of liquid to solid＞extraction times＞extraction time＞ethanol concentration,and the best match was A3B2C1D1.ConclusionThe optimum extraction conditions for Alfalfa flavonoids were established as follows: ultrasonic extraction, 60% ethanol (v/v) as solvent, ratio of liquid to solid 30∶1（V/W）, reflux extraction 3 times and 1 h for each time. The content of flavonoids in Alfalfa was 3.75%, and in leaves of Alfalfa was 4.85%.
        Key words：Alfalfa;   Flavones;   Orthogonal experiment
        紫花苜蓿简称苜蓿，为多年生草本植物，属豆科草类。因其在保健方面具有清热解毒、凉血通淋之功效，能降血脂、抗肿瘤、抑菌、利尿，而且价格低廉、资源充足，所以在食品保健领域有广泛的应用前景。
        苜蓿中含有特殊的免疫活性蛋白、皂苷、多糖、膳食纤维、黄酮以及维生素E等特殊营养功能成分［1，2］。其中黄酮类化合物是一种天然抗氧化剂，具有多种生物活性，其在抗氧化、抗衰老、抗菌抗病毒、抗癌症、抗肿瘤、护肝、抑制高血压、高血脂、调节内分泌系统、增强机体免疫力、预防心血管疾病及止痛镇痛等方面都具有良好的作用［3～5］。然而迄今有关对紫花苜蓿黄酮类化合物提取工艺的研究却未见报道。本研究采用单因素实验和正交实验对紫花苜蓿总黄酮提取工艺进行探讨，为苜蓿总黄酮的开发利用提供理论依据［6～11］。
           1   器材
        1.1   原料现蕾期紫花苜蓿〔品种为WL323〕采自于河北省保定市河北农业大学实验基地。将苜蓿洗净，40 ℃下烘干，用粉碎机在40目下粉碎成粉末。
        1 .2  试剂与仪器乙醇、石油醚、芦丁、实验用水为去离子水。VIS-7220型紫外分光光度计，F2102微型植物粉碎机，SHB-IIIA循环水式多用真空泵，KQ2200DE型数控超声波清洗器，756PC型紫外可见分光光度计（上海光谱仪器有限公司），索氏提取器等。
        2  方法
        2.1   标准曲线的绘制准确配置100 ml浓度为0.168 mg/ml的芦丁储备液。准确吸取芦丁储备液0.00，1.00，2.00，4.00，6.00，8.00，10.00 ml放入7个25 ml的容量瓶中，用30 % 的乙醇定容到刻度，在266 nm下测定吸光度并绘制标准曲线。标准曲线的线性回归方程为Y = 0.182 22×C + 0.058 53 （C: mg/ml），线性相关系数r = 0.998 8。
        2.2   单因素及正交实验设计见表1。表1  正交实验因素水平
           3   结果
        3.1   单因素实验结果与分析
        3.1.1   乙醇浓度的确定称取1 g苜蓿粉末3份，分别加入20 ml的60 %，70 %，80 %的乙醇，加热回流提取2 h， 溶液冷却后离心5 min，再取0.5 ml稀释到10 ml在266 nm下测吸光度。测定吸光度分别为0.220，0.444，0.421。
        随乙醇浓度的增加，吸光度亦随之增大。当浓度达到70 %时，黄酮类化合物溶解度最大，吸光度最高。乙醇浓度再增加，黄酮类化合物溶解度减小，同时一些醇溶性杂质、色素、亲脂性强的成分溶出量增加，这些成分与黄酮类化合物竞争同乙醇-水分子结合，从而导致黄酮化合物提取率下降。因此确定乙醇浓度为70 %。
        3.1.2    提取方法的确定称取1 g苜蓿粉末3份，分别加入20 ml 70 %的乙醇，分别用加热回流萃取、索氏提取器提取、超声萃取的方法提取2 h，然后取部分溶液离心5 min，再取0.5 ml稀释到10 ml测吸光度。测定吸光度为0.443，0.499，0.538，因此确定提取方法为超声提取法。
        3.1.3   提取时间的确定称取1 g苜蓿粉末5份，分别加入20ml 70%的乙醇，用超声萃取的方法分别提取0.5，1，1.5，2，2.5 h，然后取部分溶液离心5 min，再取0.5 ml稀释到10 ml测吸光度。测定结果为0.321，0.385，0.531，0.527，0.520。可以确定提取时间为1.5 h。
        3.1.4   料液比的确定 称取1 g苜蓿粉末4份，按1∶10，1∶20，1∶30，1∶40（g/ml）的料液比加入70 %的乙醇，用超声提取的方法提取1.5 h，然后取部分溶液离心5 min，再取0.5ml稀释到10ml测吸光度。测定结果0.512，0.537，0.602，0.497。可以确定料液比为1∶30（g/ml）。
        3.1.5   提取次数的确定称取1 g苜蓿粉末4 份，分别加入70 %的乙醇，用超声提取法分别提取1，2，3，4 次，1.5 h/次，然后取部分溶液离心5 min，再取0.5 ml稀释到10 ml，测吸光度。测定结果0.525，0.545，0539，0.521。可以确定提取次数为两次。
        3.2  正交实验结果与分析在单因素实验基础上，采用L9（34）正交实验对提取工艺条件进一步优化。结果见表2～3。
        由表2和表3知，在超声提取下，各因素对提取结果的影响大小依次为B>A>C>D，其中影响因素A、B表现为极显著，因素C表现为显著，因素D对结果的影响不显著，从节省原料的角度考虑选择60%的乙醇。所以最佳组合为A3B2C1D1。表2  正交实验设计及结果 表3  方差分析
        3.3   苜蓿中黄酮的测定准确称取1.00 g苜蓿粉末，加入30 ml 60 %乙醇，用超声法提取3 次，1 h/次。合并提取液定容到250 ml。取1 ml样液，放入25 ml容量瓶中，用30 %的乙醇稀释至刻度，试剂为空白参比。根据测得吸光度，利用标准曲线计算样品中总黄酮含量为3.81%，3.75%，3.69%。
        4  结论
        经正交实验，确定了超声法提取苜蓿总黄酮的最佳工艺为：60 %乙醇，30∶1的液固比，提取3次，1 h/次。测量结果表明苜蓿全草中含有总黄酮3.75 %，苜蓿叶子中含有总黄酮4.85 %。
       【参考文献】
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