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       【摘要】 
       目的通过牛蒡子苷对胰腺癌细胞株(CAPAN-1)体内外实验，验证其是否具有抗胰腺癌作用。方法在CAPAN-1细胞培养液中加牛蒡子苷，培养72 h并观察癌细胞的增殖抑制率及癌细胞形态变化。流式细胞仪（FCM）检测CAPAN-1细胞周期及凋亡率；TUNEL法检测CAPAN-1细胞凋亡率；免疫细胞化学检测CAPAN-1细胞的增殖凋亡调控相关蛋白(bax、bcl-2)表达。用CAPAN-1细胞制作Balb/c裸小鼠荷瘤模型，连续每天腹腔注射牛蒡子苷（10 mg·kg-1·d-1）10d，以5-FU（30 mg·kg-1·d-1）作阳性对照观察抑瘤率。结果牛蒡子苷抑制CAPAN-1细胞生长；阻滞CAPAN-1细胞周期于G0/G1期并诱导细胞凋亡；通过上调bax蛋白表达（P＜0.01），下调bcl-2蛋白表达（P＜0.05）诱导CAPAN-1细胞凋亡；抑制荷瘤裸小鼠肿瘤生长，抑瘤率为41.7%。结论牛蒡子苷具有抗胰腺癌活性，其作用机理之一是诱导细胞凋亡。
       【关键词】  牛蒡子苷； 抗肿瘤活性； 细胞凋亡； CAPAN-1细胞株
       Study on the Anti-tumor Effect and Mechanism of Arctiin on CAPAN-1 Cell Line
        ZHENG Guo-can
        （Zhongda Hospital, Southeast University, Nanjing,210009,china）
        Abstract：ObjectiveTo evaluate the anti-tumor effect and mechanism of arctiin on the human pancreas cancer cell (CAPAN-1) in vitro and vivo. MethodsCAPAN-1 cell was cultured in medium containing serial concentration of arctiin for 72 hours. Then the growth rate and the morphological change were analyzed. Cell apoptosis percentage was measured by TUNEL method and FCM. Cell cycle phase distribution was measured by FCM. The expression of proliferation and apoptosis associated proteins of bax,bcl-2 in CAPAN-1 cell were determined using immunocytochemistry. CAPAN-1 cell tumor-bearing nude mice were intraperitoneally administered arctiin and 5-FU and the tumor growth rate was observed.ResultsArctiin could inhibit proliferation of CAPAN-1 cell. The cell cycle was arrested in G0/G1 phase and apoptosis was induced（P＜0.05）. The onset of apoptosis was related to the up-regulation of bax protein（P＜0.01）and down-regulation of bcl-2 in protein level（P＜0.05）. Arctiin could inhibit the tumor growth, and inhibition rate was 41.7%.ConclusionThese studies suggest that arctiin can inhibit CAPAN-1 cells growth and one of mechnnisnms is to induce cell apoptosis.
        Key words：Arctiin；  Anti-tumor effect；  Apoptosis；  CAPAN-1 cell line
        牛蒡子是具有疏散风热、宣肺透疹、解毒利咽的中药，且常用于抗癌方剂中。牛蒡子主要含牛蒡子苷（arctiin）、牛蒡子苷元（arctigenin）、牛蒡子酚A、B（lappaol A,B）、脂肪油等［1］。近来研究表明，牛蒡子苷及牛蒡子苷元在动物体内实验中具有抗癌活性 ［2～4］。牛蒡子苷对CAPAN-1细胞是否具有抑制作用尚无报道，为进一步研究牛蒡子苷的抗肿瘤活性，利用CAPAN-1细胞进行体内外实验，探讨牛蒡子苷是否具有抗胰腺癌活性及其作用机理。
        1    材料
        牛蒡子苷购于中国药品生物制品检定所；CAPAN-1细胞株由上海细胞研究所提供；FCS-1640细胞培养液，胎牛血清，抗生素，胰蛋白酶等（GIB Co）；SP免疫组化试剂盒，小鼠抗人bcl-2及bax单克隆抗体（Santa Cruz Co）。
           2    方法
        2.1  牛蒡子苷对CAPAN-1细胞生长的影响  取FCS-1640细胞培养液中对数生长期的CAPAN-1细胞3ml(细胞浓度约为6.5×103个·ml-1)，接种于直径35mm的培养皿中。随机分为用药组和对照组。用药组分别加入用0.02%二甲亚砜溶解的牛蒡子苷0.5，1，1.5mg·ml-1；对照组加入0.02%二甲亚砜。每一浓度3个重复培养皿，培养72h，每24h用细胞计数仪检测癌细胞数，设对照组癌细胞增殖率为100%，用下面公式计算各用药组癌细胞增殖率。
        增殖率（%）=［（用药组各时段癌细胞数－用药组开始癌细胞数）/（对照组各时段癌细胞数－对照组开始癌细胞数）］×100%。
        2.2   癌细胞形态学观察  倒置显微镜下动态观察培养皿中CAPAN-1细胞用药前后的变化。
        2.3   FCM细胞周期检测    收集对照组和加牛蒡子苷1 μg·ml-1的用药组培养24，48，72h的CAPAN-1细胞；PBS洗涤后，4℃下用75%酒精固定12 h以上；离心除去酒精，PBS洗涤，加入10mg·ml-1 RNA酶溶液150 μl，37℃水浴30 min，加入碘化丙啶（PI），300目尼龙网过滤后4℃下放置15 min，用FCM测定细胞周期各时相细胞的百分比及细胞凋亡率。
        2.4   DNA末端原位标记染色法（TUNEL）检测细胞凋亡  在培养皿中放置盖玻片，CAPAN-1细胞在盖玻片粘壁生长后，用药组加入1 μg·ml-1牛蒡子苷，收集对照组和用药组培养24，48，72h附细CAPAN-1胞的盖玻片，按TUNEL试剂盒标记染色，结果判断：以细胞核内出现棕褐色为阳性。光镜下计算凋亡指数（Apoptotic index,AI）。AI是指每张TUNEL玻片选取5个阳性细胞数最多的高倍镜视野，计算阳性细胞数与总细胞数的百分比。
        2.5  免疫细胞化学检测增殖凋亡调控相关基因bax及bcl-2的蛋白表达  分别收集对照组和加牛蒡子苷1 μg·ml-1的用药组培养48 h的CAPAN-1细胞，用S-P法进行染色。小鼠bax单克隆抗体按1∶200稀释，bcl-2单克隆抗体按1∶50稀释，阴性对照以PBS代替抗体。结果判断：细胞染色呈棕黄色为阳性，随机计数100个细胞，测定每一指标的标记指数（labeling index，LI），重复3次，取均值。LI=阳性细胞数/计数细胞总数×100%。
        2.6   荷瘤Balb/c裸小鼠肿瘤抑制实验  体重21 g左右的雌性Balb/c裸小鼠20只，于裸小鼠右侧腋窝皮下接种CAPAN-1细胞2×106 个（0.1 ml），接种后第8天随机分成对照组和用药组，每组10只。牛蒡子苷组用牛蒡子苷10 mg·kg-1（用0.02%二甲亚砜溶解），阳性对照组用5-FU 30 mg·kg-1·d-1,对照组用0.02%二甲亚砜溶液，腹腔注射1次/d，连续10 d。移植肿瘤细胞第30天拉颈处死小鼠，切除肿瘤称重并按下面公式计算抑瘤率：
        抑瘤率(%) = (1－用药组平均瘤重/ 对照组平均瘤重)×100%。
        2.7    资料统计分析  所有数据资料用SPSS统计软件分析处理，实验数据用±s表示，各组间比较用t检验。
        3  结果
        3.1  牛蒡子苷对CAPAN-1细胞生长的影响  用药组与对照组相比CAPAN-1细胞数和增殖率减少，均呈浓度和时间依赖性（见图1及表1）。表1  牛蒡子苷对CAPAN-1细胞增殖率的影响
        3.2   癌细胞形态学观察  在倒置显微镜下观察CAPAN-1细胞的生长情况，见用药组癌细胞数明显减少，细胞变小，折光性差，有的细胞破碎，随后脱落飘浮在培养液中。而对照组的癌细胞形态上无明显改变，生长良好。
        3.3  牛蒡子苷对CAPAN-1细胞周期和凋亡率的影响  FCM检测结果：用药组与对照组比较细胞周期阻滞在G0/G1期，并出现细胞凋亡（见表2）。TUNEL法检测结果：用药组与对照组比较细胞凋亡率增高，差异具有显著性意义，且随处理时间增加细胞凋亡率亦增加（见表3）。 表2  牛蒡子苷对CAPAN-1细胞周期及凋亡的影响 表3  TUNEL法检测CAPAN-1细胞的凋亡率
        3.4   牛蒡子苷对bax及bcl-2蛋白表达的影响  处理48 h后，与对照组相比bax标记指数LI增加（t=38.09  P＜0.01＝，bcl-2标记指数LI降低（t=5.19  P＜0.05），见表4。表4  牛蒡子苷对CAPAN-1细胞bax、bcl-2蛋白表达的影响 与对照组相比较，* P＜0.01  **，P＜0.05
        3.5  牛蒡子苷对荷瘤Balb/c裸小鼠肿瘤抑制实验  牛蒡子苷组和阳性对照组裸小鼠平均瘤重小于对照组平均瘤重，差异具有显著性意义（t=5.89， t=12.42，P<0.01），阳性对照组裸小鼠平均瘤重小于牛蒡子苷组平均瘤重，差异具有显著性意义（t=5.89, t=12.42，P<0.01）。见表5。表5  牛蒡子苷对荷瘤Balb/c裸小鼠瘤重和抑瘤率的影响
        4  讨论
        最近实验研究表明，牛蒡子苷在动物体内实验中具有抗肺癌，白血病活性。与5-FU、环磷酰胺及顺铂合用，可减少或阻止抗癌剂抗药性的增加，并能够抑制体外培养的肿瘤细胞对葡萄糖的利用［5～8］。本实验通过对胰腺癌细胞株（CAPAN-1）的体内和体外实验，以进一步证明牛蒡子苷是否具有抗胰腺癌活性。
        在利用牛蒡子苷对CAPAN-1细胞进行的体外实验中。牛蒡子苷能抑制CAPAN-1细胞的增殖；通过观察CAPAN-1细胞的形态，观察到癌细胞生长被抑制；TUNEL标志法观察到CAPAN-1细胞凋亡；FCM检测CAPAN-1细胞周期和凋亡率结果显示，牛蒡子苷先将细胞周期阻滞于G0/G1期，然后诱导细胞凋亡。bax和bcl-2是一对凋亡相关调控基因，bax主要通过与其家族bcl-2形成二聚体而发生作用。当bcl-2表达较高时，bcl-2和bax形成异源二聚体而抑制凋亡；当bax表达较高时，bax之间形成同源二聚体而促进凋亡［9］。本实验结果表明，牛蒡子苷作用于CAPAN-1细胞后bcl-2基因表达减弱，bax基因表达增强，说明其可下调bcl-2及上调bax表达，这可能为牛蒡子苷诱导CAPAN-1细胞凋亡的机理之一。从癌细胞体外实验中可得出牛蒡子苷能抑制体外培养的CAPAN-1细胞的生长，并诱导细胞凋亡。
        在体外实验中，对癌细胞有抑制或杀伤作用的药物，在活体中由于各种综合因素的作用不一定仍具有抑制肿瘤的作用。为此进行了CAPAN-1细胞荷瘤裸小鼠肿瘤抑制实验。结果牛蒡子苷能够抑制荷瘤裸小鼠肿瘤的生长。但抑瘤率较5-FU弱，表明牛蒡子苷在活体上也具有抑制CAPAN-1细胞的活性。通过对CAPAN-1细胞的体内外实验，证明牛蒡子苷具有抗胰腺癌活性，其作用机理之一是诱导细胞凋亡。
       【参考文献】
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