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       【摘要】 
       目的优选大蓟中黄酮的最佳提取工艺。方法柳穿鱼叶苷的含量之和以及总固体得率为指标，采用正交实验法，优选提取大蓟总黄酮的最佳提取工艺。结果大蓟总黄酮提取的最佳处理条件为A3B3C1，即70%乙醇提取两次，第1次12倍量1 h，第2次10倍量30 min。结论优选的工艺条件可为新药研究和工业化生产提供参考。
       【关键词】  正交实验法； 大蓟； 提取工艺
       Study on the Extraction Process of Total Flavone in Cirsium japonicum DC. by Orthogonal Design
        LIU Sujun1,2, ZHOU Zebin1, WANG Yinghong1, GUO Hong2 
        （1. Leshan Normal College, Sichuan, 610400, China; 2. Sichun Rural Science and Echonology Development Center, Chengdu 610401, China）
        Abstract：ObjectiveTo optimize the extraction process of total flavone in Cirsium japonicum DC．.MethodsOrthogonal test was employed for selecting the optimum extraction process by the indexes of the contents of pectolinarin with HPLC analysis and total solid matters．ResultsThe best extraction technology was A3B3C1，that meant the raw drug materials were extracted twice，1 h for first by adding 12 times of 70％ alcoho1．30 minutes for second by adding 10 times of 70％ alcoho1.ConclusionThe optimum extraction process condition of total flavone in Cirsium japonicum DC. provides scientific base for large production．
        Key words：Orthogonal test；  Cirsium japonicum DC.；  Extraction process
        大蓟为菊科管状花亚科菜蓟族蓟属植物Cirsium japonicum DC. 的干燥地上部分或根［1］，多年生草本，高100～150 cm，茎直立，密被白毛，叶互生；叶片倒卵状长椭圆形，边缘具浅裂和斜刺，被毛；5～6月开花，头状花序顶生，花单生，紫红色，瘦果扁椭圆形，生于山野路边，以全草和根入药，我国大部分地区均有分布。全草灰绿色，大蓟性凉，味甘、苦,归心、肝经，功效为凉血止血、祛淤痛，主治吐血、衄血、尿血、血淋、血崩、带下、肠风、 肠痈、痈疡肿毒、疔疮、高血压病及肝炎等。其化学成分复杂，主要含有黄酮、黄酮苷、挥发油、三萜和甾醇等物质。大蓟在民间验方多用于治疗癌症，如：大蓟根、三白草根治肝癌；鲜大蓟叶与鸡蛋清搅拌后贴于患处，可治乳腺癌等。赵鹏等用大蓟提取物对Hep细胞毒性的研究表明，大蓟提取物能抑制Hep细胞的生长，并能提高Hep荷瘤小鼠的免疫功能。本实验的结果表明大蓟黄酮能有效抑制肿瘤的生长。但是对于大蓟总黄酮的提取，目前大蓟总黄酮的提取率和纯度均不高，也没有成熟的提取工艺。本研究的目的是通过应用正交实验法筛选出大蓟总黄酮的最佳工艺，为工业化生产提供技术指导。
           1   材料与仪器
        大蓟药材购于成都市中药饮片供应站，经四川大学植物标本馆鉴定为菊科植物Cirsium japonicum DC.干燥根。流动相用甲醇为色谱纯,其余均为分析纯;柳穿鱼叶苷对照品自制。
        HP1100型高效液相色谱仪(美国惠普公司)，HP8453紫外分光光度计(美国惠普公司)。
           2   方法与结果
        2.1   柳穿鱼叶苷含量的HPLC测定［2］色谱条件：流动相A为pH=3.0的磷酸溶液；流动相B为甲醇。梯度洗脱，0～8 min 30% ～50% 的流动相A；8～40 min 50% 的流动相A。流速0.76 ml/min，二极管阵列检测器检测。
        2.2   大蓟总黄酮含量的UV测定［3］精密称取柳穿鱼叶苷对照品8.23 mg置10 ml量瓶中，以甲醇溶解定容。以此为母液,依次配成2.06，4.12， 6.18，8.24，10.3 ng/ml 5个浓度梯度的对照品溶液。分别测定250 nm处的吸光度值。以吸光度值为纵坐标， 柳穿鱼叶苷对照品浓度为横坐标，绘制标准曲线，计算得回归方程：Y=67.582X+0.013 43,r=0.999 8。总黄酮以柳穿鱼叶苷计在0.004 5～0.020 3 mg/ml间线性关系良好。
        2.3   浸膏得率的测定方法取大蓟的提取液50 ml，置已干燥至恒重的100 ml蒸发皿中，水浴蒸干后，置烘箱内105℃干燥3 h，取出置干燥器内冷却30 min，迅速精密称定质量。
        2.4   不同溶剂的浸膏得率取大蓟20 g置800 ml烧杯中，加200 ml水，浸泡30 min，煮沸1 h，纱布滤过，药渣用160 ml水再煮沸30 min，纱布滤过，合并两次的滤液，作为水煎提取液。取3份20 g的大蓟，置500 ml圆底烧瓶中，分别以30%，60%，90%乙醇200 ml回流提取1 h，纱布滤过，药渣再用160 ml溶剂再回流提取30 min，纱布滤过，合并两次滤液，作为乙醇回流提取液。不同提取方法比较结果见表1。从表1可以看见，从大蓟总黄酮和柳穿鱼叶苷的提取率来看，以60%乙醇为溶剂的提取率较高。
        表1  不同提取方法比较结果%
        提取方法总黄酮提取率柳穿鱼叶苷提取率浸膏得率水煎提取7.673.5929.2030%乙醇提取7.303.3922.1260%乙醇提取13.204.3323.9490%乙醇提取6.523.2515.84
        2.5   乙醇提取工艺优选［4］以上提取实验表明，选取60%乙醇提取大蓟总黄酮和柳穿鱼叶苷较为合适。在整个提取过程中，提取所用乙醇的浓度和量以及提取时间对大蓟有效成分的影响较大，故采用正交实验进一步优选醇提的最佳条件按L9(34)正交表进行实验，因素水平见表2。
        称取大蓟各20 g，按L9(34)正交实验设计表的条件进行实验。提取液滤过后合并，分别测柳穿鱼叶苷、大蓟总黄酮、浸膏得率，并进行多指标综合评分。见表3～4。
        直观分析表明，以综合评分为标准，在所选因素水平范围内，乙醇的加入量对大蓟的提取效果影响最大，乙醇浓度影响较小，而提取时间影响最小。方差分析表明，因素B(乙醇的加入量)为主要影响因素，具有显著性，因素A和C不显著。故选取最佳提取条件为A3B3C1，即70%乙醇提取两次，第1次12倍量1 h，第2次10倍量30 min。表2  正交实验因素水平
        2.6   验证实验根据优选得到的大蓟总黄酮提取最佳工艺A3B3C1，进行正交验证实验，大蓟总黄酮提取率为10.3%，柳穿鱼叶苷提取率为4.62%，浸膏得率为20.9%(n=3)。表4  方差分析
        3  讨论
        大蓟中柳穿鱼叶苷为止血的主要成分。本研究表明大蓟黄酮能有效抑制肿瘤的生长。目前，对于大蓟黄酮的提取还没有一个成熟的工艺，总黄酮的提取率和纯度均不高。根据黄酮的理化性质，黄酮的极性较大特别是苷类，易溶于水、甲醇、乙醇等有机溶剂，甲醇有视神经毒性，因此选用水和乙醇作为提取溶剂，以总黄酮提取率、柳穿鱼叶苷提取率和浸膏得率为指标，经过初步筛选，从表1可见，60%乙醇为溶剂的提取率较高。在大蓟黄酮的提取过程中，所用溶剂的量和提取时间对大蓟黄酮的含量和得率都有影响。通过正交实验表明，乙醇的用量对它的影响极显著，提取时间对它的影响较小。因此，大蓟黄酮提取的最佳工艺为70%乙醇提取两次，第1次12倍量1 h，第2次10倍量30 min。
        该工艺可提高大蓟中黄酮的提取率和纯度，本工艺先进合理、实用可行，有利于大蓟中黄酮提取的工业化生产。
       【参考文献】
         ［1］ 国家药典委员会.中国药典,Ⅰ部［S］.北京:化学工业出版社,1999:19.
       
       ［2］ 仲 英,王 菊,杨尚军,等.高效液相色谱法测定不同地区葛根中葛根素含量［J］.时珍国医国药,2000,11(12):1059.
       
       ［3］ 徐新刚,路富玉,隋晓春,等.正交试验优选葛根提取工艺［J］.时珍国医国药,2000,11(9):780.
       
       ［4］ 邓铁宏，徐颖娟，刘志梅，等.俞风宁口服液制备及总黄酮含量测定［J］.沈阳药科大学学报，1998，15（4）：291.