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       【摘要】 
       目的优化竹叶总黄酮的分离纯化工艺。方法采用单因素实验，以芦丁为标准品，用分光光度法测定样品中总黄酮含量。结果乙醇浸取浓度、萃取有机溶剂、大孔树脂以及乙醇洗脱浓度对竹叶总黄酮的分离纯化有一定影响。结论竹叶粉末采用75%乙醇提取，氯仿萃取除杂质，再经D101大孔树脂吸附，70 %乙醇洗脱，可使总黄酮含量达到85%以上。
       【关键词】  竹叶； 总黄酮； 提取工艺
        Separation and Purification of Total Flavone from Bamboo Leaves
        TANG Bo1,  LIU Huoan2, JIA Yun1
        (1.College of Chemistry and Chem-engineering, Science and Technology of Chongqing University, Chongqing 400042, China；2. Department of Biology, Science and Technology of Chongqing University, Chongqing 400042, China)
        Abstract：Objective：To optimice the extraction technology of total flavone in bamboo leaves. Methods Single factor was utilized to optimize extracting process. Concentration of total flavone was measured by the spectrophotometer, rutin used as standard sample.ResultsContent of ethanol, extracts of organic solution, washoff solution and different kind of resin had effect on the extraction of total flavone from bamboo leaves. ConclusionWhen powder of bamboo leaves was extracted with 75% alcohol, chloroform is used to remove impurity, D101 resin is used for adsorption, then 70% alcohol is used to wash-off,  the final  concentration of total flavone can exceed 85%.
        Key words：Bamboo leaves；  Total flavone；  Extracting technology 
        竹叶为禾本科纲竹属植物毛竹Phyllostachys pubescens的叶子。竹叶黄酮有抗衰老、抗应激、抗疲劳、调节血脂、阻断亚硝化反应、增强免疫能力、抗菌、抑菌等作用［1］。目前竹叶黄酮被大量应用于药品、食品、化妆品等生产中。
        竹叶是在竹材加工过程中的剩余物，目前还没有被充分利用。竹叶主要含有黄酮类化合物，用不同溶剂对黄酮类化合物成分进行提取分离鉴定， 表明竹叶Phyllostachys pubescens黄酮类化合物主要成分为碳苷类黄酮化合物，如牡荆苷、异牡荆苷、荭草苷、异荭草苷等。黄酮类成分有明显的抗溃疡、解痉、抗菌、抗炎、降血脂、镇痛和雌性激素等生物活性和生理活性作用。大孔吸附树脂提取黄酮类化合物已有许多报道，如用DA型大孔吸附树脂提取四季青总黄酮；应用D101吸附树脂精制银杏叶提取物(GBE)，制得含黄酮约38%的GBE产品；也有用ZTC澄清剂沉降，在酸性条件下吸附，制得GBE成品的黄酮含量在26 %以上［2］。
        大孔吸附树脂是一种多孔性的高分子材料，具有多孔性和较大的比表面积，主要通过物理作用从溶液中有选择性地吸附有机物质，从而达到分离纯化的目的［3］。大孔树脂纯化技术是中药制药工业中颇具发展前景的实用新技术之一，已被成功地应用于黄酮类、皂苷类、生物碱类等药物的提取分离。
        本实验采用大孔吸附树脂对竹叶总黄酮进行分离纯化，并对影响提取的一个关键因素进行优化，以期找到最佳的制备方法。
       1  仪器与试剂
        1.1  仪器日本岛津UV1601型紫外可见分光光度计；大孔树脂分别购于日本三菱公司（SP825，SP207，SP700）、成都晨光化工研究院（AB8，X5，D101）及天津南开大学（HP20，HP2MG，HP2MGL，NKA9）。
        1.2  试药竹叶自采于重庆江津，晒干后，粉碎过筛，取过20～40目的粉末作为浸提实验材料；芦丁对照品（中国生物制品检定所）；其余试剂均为分析纯。
           2  方法与结果
        2.1   竹叶总黄酮含量的测定［4］精密称取于120℃干燥后的无水芦丁20 mg，用水溶解，定容100 ml，得浓度为0.2 mg/ml的芦丁标准液。分别精确量取上述标准液1，2，3，4 ml和5 ml置于10 ml的容量瓶中，用60％的乙醇补充至5 ml，各加5％的NaNO2溶液0.3 ml，摇匀，放置6 min，再各加10％的Al(NO3)3溶液，摇匀，放置6 min，加入1 mol/L的NaOH溶液4 ml，稀释至刻度，放置20 min，在510 nm处测定，以吸光度A对浓度C进行线性回归。
        C=1.847 5A-1.619 3，r=0.999 9
        结果表明，芦丁水溶液在0.02～0.1 mg/ml范围内与其吸收度呈良好的线性关系。
        移取适量竹叶提取液于10 ml容量瓶中，用60％的乙醇补充至5  ml，按上述测芦丁的方法依次加入NaNO2，Al(NO3)3，NaOH，放置20 min，在510 nm处测定吸光度，根据标准曲线求出相应的黄酮浓度。
        2.2  最佳乙醇提取液浓度的选择黄酮类化合物在植物中大多以黄酮苷或游离苷元的形式存在，而黄酮苷和游离苷元在水中的溶解度相对较小，易溶于甲醇、乙醇、醋酸乙酯等有机溶剂。所以，醇提法就成了从植物中提取黄酮类物质最常用的一种方法。因此，对最佳乙醇浓度进行了实验，称取过筛的竹叶粉末10 g 5份，置锥形瓶中，分别用95%，85%，75%，65%，55%的乙醇各100 ml于65℃恒温水浴中进行提取，时间3 h，分别检测浸取液总黄酮含量。结果见图1。
        2.3  萃取液的选择取20 g经过筛的竹叶粉，加入200 ml一定溶度的乙醇溶液，减压回流浸取3 h，趁热抽滤得到浸取液，将浸取液静置至室温后测定其总黄酮含量，蒸干浸取液即得粗提物。称取一定量的粗提物，配制成一定浓度的水溶液（即原料液），分别用石油醚、氯仿、醋酸乙酯萃取至有机相色淡，收集水相，减压浓缩干燥。检测含量结果见表1，说明氯仿萃取效果最好，萃取后的总黄酮提高了2倍多，而其它两种萃取剂对总黄酮变化不大。
        图1  乙醇浓度对粗提液黄酮含量的影响
        说明当乙醇浓度为75％时，粗提液中的总黄酮达到最大。表1  有机溶剂萃取对总黄酮含量的影响
        2.4  大孔树脂的筛选
        2.4.1  静态吸附和解吸取10种前处理的大孔树脂各20 g，分别加入竹叶提取液100 ml，每5 min振摇1次，2h后分别测定树脂对竹叶总黄酮的吸附率。然后将已吸附的树脂过滤抽干，用70％的乙醇解吸，每5 min振摇1次，2 h后分别测定树脂对竹叶总黄酮的解吸率。结果见表2。 表2  大孔树脂对竹叶总黄酮的吸附率与解吸率实验结果表明，吸附率大于90%，解吸率大于60%的有AB-8，HP20，SP207，D101等4种大孔树脂。
        2.4.2  动态吸附和解吸取静态吸附优选后处理好的4种树脂各10 ml于树脂柱内，加竹叶粗提液于柱顶，以2 BV/h的流速进行动态吸附，按树脂床体积的倍数时收集流出液，测定竹叶总黄酮的含量，绘制各树脂的泄漏曲线，结果见图2。然后先用5BV 水以2 BV/h的流速洗脱，再以70%乙醇以2 BV/h的流速洗脱，按树脂床体积收集，于510 nm处测定吸光度，计算乙醇洗脱液中总黄酮的浓度。结果见表3。表3  动态解吸结果从图2和表3可以看出，树脂D101所吸附的竹叶总黄酮的量较大，解吸效果最好。
        2.5  乙醇洗脱浓度取竹叶粗提液10 ml，加于D101树脂柱上，以2BV/h的流速进行吸附，再以5 BV水洗脱后，分别用10%，30%，50%，70%，90%乙醇洗脱，收集洗脱液至100   ml，于510 nm处测定吸光度，计算总黄酮的浓度。表4  乙醇浓度考察结果从表4可知，当乙醇浓度为70%时，洗脱效果最好。
        2.6  竹叶总黄酮的制备竹叶粉末10 g加入75%乙醇100 ml，65℃恒温水浴中进行提取3 h。减压回流乙醇得粗提液，氯仿萃取除杂质，用过滤后经D101大孔树脂吸附，70 %乙醇洗脱，收集洗脱液，减压浓缩至浸膏再经真空干燥,得到黄色粉末, 检测其总黄酮含量为87.63 %。
        3  讨论
        在竹叶总黄酮的提取中，本实验筛选影响提取效率的几个主要因素，通过实验表明，竹叶粉末用75%乙醇提取，氯仿萃取除杂质，再经D101大孔树脂吸附，70 %乙醇洗脱，可使总黄酮含量达到85%以上。
       【参考文献】
         ［1］ 张 英.竹叶黄酮的生理和药理活性［J］.世界竹藤通讯，2004,2(2)：1.
       
       ［2］ 李洪玉，孙静芸，戴诗文. 竹叶黄酮提取物的生产工艺条件研究［J］.中国现代应用药学杂志, 2004, 21(5): 371.
       
       ［3］ 刘彬果，郭文勇.大孔树脂吸附技术在中药制剂中的应用［J］. 解放军药学学报，2003，19(6)：452.
       
       ［4］ 刘 江, 周荣琪. 竹叶提取物总黄酮含量测定方法的改进［J］.食品科技, 2005, 7：76.