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       【摘要】 
       目的研究玉竹多糖（PoPs）对实验性糖尿病大鼠胰岛β细胞损伤的保护作用及其机制。方法将四氧嘧啶按180 mg/kg一次性腹腔注射诱导实验性糖尿病，给予玉竹多糖干预。观察体重、空腹血糖（FBG）的变化，并检测给药30d后大鼠的血清胰岛素（INS）以及胰腺中丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、过氧化氢酶（CAT）的水平，取胰腺组织做HE染色观察胰岛损伤情况。结果四氧嘧啶诱导的实验性糖尿病大鼠胰岛细胞存在明显的氧化应激损伤。PoPs呈计量依赖性地改善糖尿病大鼠的体重下降，降低FBG，使胰腺组织MDA含量降低，SOD，GSH-Px，CAT活力增强，HE染色显示胰岛损伤减轻，与糖尿病模型组比较具有明显的统计学差异（P＜0.05），但PoPs对INS无明显影响。结论玉竹多糖具有降血糖、抗氧化应激作用，对四氧嘧啶糖尿病大鼠的胰岛β细胞损伤有明显的保护作用。
       【关键词】  玉竹多糖； 四氧嘧啶； 糖尿病； 胰岛β细胞； 氧化应激
        Protective Effect of Polygonatum odoratum  Polysaccharides on Pancreatic β-cell Damage in Alloxan-induced Diabetes in Rats
        XIE Jianjun1，   HU Manjing2，SUN Guiju3，WANG Changsong2，ZHU Xinyi2
        （1. School of Clinical Medicine, Southeast University，Nanjing，210001，China；2.Dept.of TCM，The Zhongda Hospital Affilliated Southeast University ，Nanjing，210009，China； 3.Dept.of Nutrition and Food Hgyiene，The School of Public Health，Southeast University，Nanjing，210009，China）
        Abstract：ObjectiveTo evaluate the possible protective effects and mechanism of Polygonatum odoratum polysaccharides(PoPs)against β-cell damage in experimental alloxan-induced diabetes in rats.MethodsAlloxan was injected intraperitoneally at a single dose of 180mg kg-1 for induction of diabetes.After  oral administration with PoPs30 consecutive days for，the level of body weight,the fasting blood glucose（FBG）, INS in serum and malondialdehyde(MDA), superoxide dismutase (SOD), glutathione peroxidase (GSH-Px), catalase(CAT)contents in pancreatic homogenates were assayed by spectrophotometry.Pancreas samples were stained with hematoxylin-eosin (HE) and examined under a light microscope.ResultsAlloxan successfully induced experimental diabetes in rats，pancreatic island significantly damaged by oxidative stress.Treatment with PoPs markedly increased body weight，decreased fasting blood glucose levels；Furthermore, PoPs significantly blocked the increase of MDA production and increased SOD，GSH-Px，CAT activity in  pancreatic homogenates in a dose dependent manner as compared wiht the diabetic control(P＜0.05).Histopathological showed that the size and cell number of islets were reduced in diabetic control group and PoPs  restored the damage of pancreas tissues in rats with diabetes mellitus. But PoPs had no significant influence on INS in serum.ConclusionPoPs has protective effect on  pancreatic β-cell damage and the mecharulm may be related wiht hypoglycemic effect and reduction of oxidative stress in alloxan-induced diabetes in rats.
        Key words：PoPs；  Diabetes；  Alloxan；  Pancreatic β-cell；  Oxidative stress
        玉竹Polygonatum odoratum，又名葳蕤、女萎，为百合科黄精属植物，《神农本草经》将其列为上品，其性微寒，味甘平，归肺、胃经，传统医学用于治疗肺胃阴伤，燥热咳嗽，咽干口燥、内热消渴等症候。现代药理学研究发现，玉竹中含有多糖、甾体皂苷、黄酮、生物碱、强心苷等多种成分。玉竹的提取物有降血糖，降血脂，抗动脉硬化，抗肿瘤等多种功效［1］。玉竹中含量最高的玉竹多糖（polygonatum odoratum polysaccharides ，PoPs）可能是其药理作用的主要有效成分之一。为进一步探索和证实PoPs治疗糖尿病的起效机制，本实验利用四氧嘧啶建立糖尿病动物模型，观察PoPs干预后是否可以对四氧嘧啶导致的胰岛β细胞损伤产生保护作用。
           1  材料与仪器
        1.1  动物雌性SD大鼠，体重180～220 g，由东南大学实验动物中心提供。动物置代谢笼中单只饲养，自由进食水。动物房内保持温度(21±1)℃ ，相对湿度(60±5)％。
        1.2   药品和试剂玉竹饮片( 河南洛阳产，购于东南大学附属中大医院中药房)。玉竹多糖由本实验室采取水煎醇沉法提取，经离子交换层析和凝胶层析分离纯化，精制PoPs为白色无定型粉末，干燥样品中多糖含量以葡萄糖计为88.65％。四氧嘧啶（alloxan）:美国Sigma公司产品，实验前用生理盐水新鲜配制成2%的溶液；二甲双胍(250 mg/片) :江苏苏中药业集团股份有限公司生产。
        1.3  主要仪器722光栅分光光度计(上海第三分析仪器厂)；JA2003电子天平等。
        2  方法
        2.1  糖尿病大鼠模型的建立、分组和处理取健康大鼠80只，适应性饲养3 d后，随机留取10只作为正常对照组。其余70只大鼠禁食不禁水12h，按180 mg/（kg·bw）的剂量一次性腹腔注射2%四氧嘧啶溶液。72h后禁食5h尾静脉取血测定空腹血糖，以血糖值11.1～25mmol/L，并出现多饮、多食、多尿者确定为糖尿病模型。选择符合标准的模型动物50只，按空腹血糖和体重水平，随机分为玉竹多糖高剂量组［2.5 g/（kg·bw）］、中剂量组［1.0 g/（kg·bw）］、低剂量组［0.5 g/（kg·bw）］、二甲双胍组［0.2 g/（kg·bw）］和模型对照组，每组10只（组间差血糖不大于1.1 mmol/L）。分组后将大鼠置代谢笼单只饲养，各剂量组和二甲双胍组分别给予相应药品灌胃, 正常组和模型对照组灌服生理盐水。各组均以1.5 ml/100 g的容积灌胃。以分组给药当日计时（1 d），将每日药量分为2次灌胃，连续30 d。
        实验期间分别记录第1天及第30天大鼠的体重，尾静脉取血测定第1及30天大鼠禁食5 h的空腹血糖。末次灌胃大鼠禁食5 h后，以2%戊巴比妥钠麻醉，股动脉取全血分离血清用于测定胰岛素，切开腹腔迅速取出胰腺，用冰生理盐水漂洗干净，在胰尾部取约3 mm3大小组织3块浸入10倍体积10％中性甲醛溶液中固定，用于胰岛组织病理学检测。用滤纸将剩余胰腺组织拭干，准确称取0.3 g组织，剪碎后置于玻璃匀浆器中，加入9倍体积PBS（0.01 mol/L，pH 7.4）缓冲液，于冰水浴中制成10%的组织匀浆，3 000 r/min离心15 min，吸取上清液用于相应氧化指标的检测。
        2.2  生化检测方法血糖测定采用葡萄糖氧化酶法，丙二醛（MDA）采用TBA比色法，超氧化物歧化酶(SOD)采用黄嘌呤氧化酶法，谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）采用DTNB直接法，过氧化氢酶（CAT）采用钼酸铵比色法，试剂盒均购自南京建成生物研究所；血清胰岛素采用放射免疫法测定，试剂盒购自北京北方生物技术研究所。检测时严格按照试剂盒说明操作。
        2.3  胰岛组织形态学检查用10%中性甲醛固定胰腺组织24h，常规石蜡包埋切片，片厚3～4 μm，作HE染色。由两位专业病理人员采用盲法阅片，每张切片连续观察10个视野，计数低倍镜(100×)下平均胰岛数量和高倍镜（400×）下每个胰岛内平均细胞数，然后进行组间统计。
        2.4  统计学分析及结果判定定量数据以±s表示，应用SPSS10.0统计软件包进行数据处理分析，两样本均数间比较采用t 检验。P＜0.05表示有显著性差异，P＜0.01表示差异有极显著性。
           3  结果
        3.1  各组存活数目实验过程中共死亡大鼠17只,其中前期高血糖造模过程9只，后期模型对照组大鼠死亡2只，玉竹多糖低、中、高剂量组分别死亡2只、1只、1只，二甲双胍组死亡2只。正常组全部存活。死亡大鼠不列入统计。
        3.2  PoPs对糖尿病大鼠体重的影响各组大鼠体重在造模前无明显差异（P＞0.05），糖尿病大鼠实验期间体重增长缓慢，甚至部分出现负增长，实验结束时与正常大鼠比较有极显著性差异（P﹤0.01）。PoPs中、高剂量组大鼠体重增长均明显高于糖尿病模型组（P﹤0.05）。二甲双胍组大鼠体重增长与糖尿病模型组比较亦有明显差异（P﹤0.05）。结果见表1。表1  PoPs对糖尿病大鼠第1天及第30天体重和血糖的影响与正常组比较，**P＜0.01 ；与模型对照组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01
        3.3  PoPs对糖尿病大鼠空腹血糖（FBG）和胰岛素（INS）分泌的影响药物干预前，注射四氧嘧啶造模各组与正常对照组相比均有高基线的空腹血糖水平（P＜0.01），且组间无显著性差异（P＞0.05）。实验期间糖尿病模型组显示持续的高血糖。PoPs各剂量组给药后血糖缓慢下降，实验结束时与糖尿病模型组比较有显著性差异，尤以中高剂量组降血糖作用明显（P＜0.05）。二甲双胍组与糖尿病模型组相比则有极显著性差异（P＜0.01）。各给药组与糖尿病模型组的血清胰岛素含量均无明显差异。结果见表1及图1。
        3.4   PoPs对糖尿病大鼠胰腺组织中MDA，SOD，GSH-Px及CAT含量的比较见表3。与正常对照组相比，糖尿病模型组大鼠胰腺组织中MDA含量极显著增高（P＜0.01），SOD，GSH-Px，CAT活性则极显著降低（P＜0.01）。与糖尿病模型组相比，PoPs中高剂量组胰腺组织中SOD，GSH-Px，CAT的活性明显升高(P＜0.05)，MDA含量明显降低(P＜0.05)。二甲双胍对胰腺中MDA，SOD，GSH-Px，CAT的含量无明显影响。结果见表2。
        3.5  胰岛组织形态学检查正常组大鼠胰岛排列呈团索状，细胞浆丰富，每个低倍镜下平均胰岛数量为3.61个，高倍镜下每个胰岛内细胞数平均为64.8个。糖尿病模型组胰岛大小不等，较正常胰岛显著萎缩，胰岛数目和胰岛内细胞数极明显减少(P< 0.01)。与糖尿病模型组相比，PoPs中、高剂量组的胰岛数目和胰岛内细胞数均明显增加(P<0.05，P<0.01)。二甲双胍组胰岛数目和胰岛内细胞数与糖尿病模型组相比无明显差异。见图2及表3。表2  PoPs对糖尿病大鼠胰腺组织MDA，SOD，GSH-Px，CAT的影响 与正常组比较，**P＜0.01；与模型对照组比较，△P＜0.05  表3  PoPs对糖尿病大鼠胰岛病理学变化的影响
           4  讨论
        机体在生理状态下，体内产生的少量自由基可作为信号分子,参与体内防御反应及调节血管舒缩等正常代谢；但在病理条件下，过多的自由基可以直接引起生物膜脂质过氧化、细胞内蛋白及酶变性、DNA损害，导致细胞死亡或凋亡［2］。研究表明，在糖尿病的自然病程中，胰岛β细胞分泌胰岛素的功能呈进行性衰竭，自由基反应和氧化应激损伤可能是加重胰岛β细胞衰竭的一个重要作用机制［3～4］。糖尿病体内存在的高葡萄糖血症、游离脂肪酸增加、高瘦素血症等均能诱导超量ROS的产生，引起氧化应激损伤［5］。对于抗氧化酶含量较低的胰岛β细胞，这一作用更为明显。糖尿病发病始于胰岛β细胞功能下降，而病程中又存在ROS对残存胰岛β细胞的不断损伤，即R. Paul Robertson称为的双重打击作用［6］。ROS除直接造成胰岛β细胞结构的损伤外，还能够减少胰岛β细胞中与胰岛素启动子和胰岛素基因转录有关的两种调节蛋白PDX-1和MafA的表达，引起胰岛素启动子活性及胰岛素基因表达水平的降低［7］。早期应用抗氧化剂干预胰岛β细胞的氧化应激反应，维持胰岛β细胞抗氧化防御系统的平衡状态，对保护糖尿病患者残存的胰岛功能有益，并能延缓糖尿病患者从糖耐量降低到胰岛素依赖的进展［8］。
        四氧嘧啶（alloxan）是一种经典的致糖尿病药物，具有独特的胰岛β细胞毒作用。目前认为alloxan的致糖尿病作用与超量ROS的产生有关。Matthias Elsner研究四氧嘧啶的致糖尿病机制发现，四氧嘧啶经过氧化-还原反应变成代谢物5-羟巴比土酸的过程中产生大量ROS（O-2·，H2O2，·OH），由于胰岛β细胞内对ROS有清除作用的抗氧化酶，如SOD，GSH-Px，CAT表达水平较低，不能对抗由ROS介导的氧化应激损伤，影响胰岛β细胞基因的表达，造成大量β细胞凋亡或死亡，动物出现严重的代谢紊乱［9］。本实验研究显示，与正常大鼠相比较，糖尿病模型大鼠胰腺组织中脂质过氧化产物MDA含量增加，抗氧化酶SOD，GSH-Px，CAT的活性降低，组织病理显示胰岛数目和胰岛内细胞数极明显减少(P＜0.01)，表明糖尿病大鼠胰腺组织中抗氧化防御系统的功能降低，清除自由基系统明显受损，胰岛β细胞过氧化损伤作用增强，即处于明显的氧化应激状态。
        玉竹在《神农本草经》中被列为上品，是祖国医学治疗“消渴病”的常用药物。《日华子本草》记载，玉竹“除烦闷，止渴，润心肺，补五劳七伤，虚损……”。已有研究表明，玉竹提取物对正常及链脲佐菌素高血糖大鼠［10］均有降低血糖作用，作用机制与提高胰岛素的敏感性有关［11］。本实验研究显示，与糖尿病对照组相比，PoPs中、高剂量组大鼠体重下降趋缓，表明经PoPs治疗后大鼠体内合成代谢增强；PoPs中、高剂量大鼠空腹血糖明显下降(P＜0.05），但血清INS无明显变化(P＞0.05)，说明PoPs具有降血糖作用，且不依赖于体内INS释放的增加，这对于处于衰竭状态的胰岛β细胞得以休息，促进胰岛功能的修复和好转非常有益。PoPs的降血糖作用虽然弱于二甲双胍，但实验显示，PoPs具有降糖作用以外的优势。经PoPs治疗后，大鼠胰腺组织中抗氧化酶SOD，GSH-Px，CAT的活性明显增强，过氧化产物MDA的含量明显降低；组织病理显示胰岛数目和胰岛内细胞数均较糖尿病模型组明显增加(P＜0.05)，表明PoPs通过增强糖尿病大鼠胰岛组织抗氧化酶的活性，加大对自由基的清除，减轻大量自由基对胰岛β细胞的过氧化损伤，促进了受损的胰岛β细胞的修复与再生。作用效应与PoPs的浓度存在计量依赖关系。我们的研究显示，PoPs对四氧嘧啶所致的糖尿病大鼠胰岛β细胞的功能具有保护作用，机制可能与改善糖尿病大鼠的糖代谢紊乱，减轻胰岛β细胞的氧化应激损伤有关。
       【参考文献】
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       ［10］ 丁登峰,向大雄，刘 韶，等. 玉竹多糖的提取及其对链脲佐菌素诱导糖尿病大鼠血糖的影响［J］.中南药学，2005,8（4）:222.
       
       ［11］ Choi SB,Park S.A steroidal glycoside from Polygonatum odoratum (Mill.) Druce, improves insulin resistance but does not alter insulin secretion in 90% pancreatectomized rats［J］.Bio science,Biotechnology,And Biochemistry，2002, 66(10): 2036.