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       【摘要】 
       目的建立知母中总黄酮提取工艺，为知母总黄酮开发和利用提供依据。方法对提取方法、提取溶剂、提取时间进行研究，采用紫外分光光度法测定知母中总黄酮含量。结果知母中总黄酮较佳提取工艺为： 70% 乙醇超声提取 30min。结论该方法简便、快速、准确，可作为知母中总黄酮提取及含量测定方法。
       【关键词】  知母； 紫外分光光度法； 总黄酮； 芒果苷
       Study on extraction technology of total flavonoids of Anemarrhena
        WEN Yongju1，NENG Liqiang2,SHEN Xiuli1
        （1. Yichun University，Yichun，336000 China；2. Yichun University Pharmacy of 2003 grade，336000 China）
        Abstract：ObjectiveTo estable a method of extraction technology of total flavonoids to offer a basis for Anemarrhena"s development. MethodsIt was studied on method, solvent, time of extraction of Anemarrhena"s tatol flavonoids and was determined tatol flavonoids" content of Anemarrhena by UV-spectrophotometry. ResultsIt was best extraction technology of Ultrasonic Extraction total flavanoids for 30min by 70% acohol.ConclusionThis method was simple, quick, and accurated, and suitable to extract and determine total flavonoids" content of Anemarrhena.
        Key words：Anemarrhena；  UV-spectrophotometry;  Total flavonoids；  Mangiferin
        知母为百合科植物知母Anemarrhena asphodelloides Bge.的干燥根茎。中医理论认为，知母性寒，味苦、甘；入肺、肾、胃经；具有清热泻火、生津润燥功能。临床用于外感热病、高热烦渴、肺热燥咳、骨蒸潮热、内热消渴、肠燥便秘［1］等症。研究表明知母中富含皂苷、黄酮类化合物 ［2］，其总黄酮又以芒果苷含量最高［3］。具有抗病原微生物、抗血小板聚集、降血糖、解热、抗炎、降低转氨酶等生理活性［4，5］，芒果苷是其止咳的有效成分。对于知母的化学研究，文献多偏重其皂苷类成分提取分离纯化研究，忽视了知母另一类有效成分——总黄酮类成分研究。因此，很有必要对知母总黄酮进行提取工艺研究。
           1  仪器与试药
        1.1   仪器精密天平 BS224S（德国塞多利斯）；UV-4501S 紫外分光光度计(天津市港东科技发展有限公司)；超声清洗机 SK8210LHC（上海科导超声有限公司）。
        1.2  试药知母（产地河北，河南，安徽）；芒果苷为对照品（中国生物制品检验所，批号111607－200301）；乙醇、甲醇均为分析纯。
       2  方法与结果
        2.1  实验条件与方法的建立
        2.1.1  对照品的选择很多文献报道中药制剂中总黄酮的含量测定多数采用芦丁作为对照品。采用芦丁作为对照品，解决了部分中药或中药制剂中本身缺少黄酮对照品的问题，在没有合适的对照品情况下，也不失一种测量总黄酮的可行的方法。芒果苷是知母中含量较高的黄酮类化合物，是其清热作用的有效成分，同时还具有抗炎、抗病毒、抗氧化、免疫抑制、利尿、预防肥胖等作用。因此，用知母中含量较高且具有抗病毒作用的专属性活性成分作为对照品来测定知母总黄酮的含量更加有意义。
        2.1.2  最大吸收波长的选择  NaNO2-Al（NO3）3-NaOH比色法测定总黄酮的原理［6］，是黄酮母核所含有的游离羟基在 NaNO2-Al（NO3）3 存在的条件下与金属铝离子形成络合物而显色，在波长 500 nm 左右有最大吸收。本实验中所用的对照品是知母中主要黄酮类成分芒果苷对知母总黄酮进行含量测定。因此将芒果苷溶液及知母总黄酮提取液显色后在 200～400 nm 处用可见-紫外分光光度计扫描，知母总黄酮和芒果苷均在 258nm 有最大吸收波长，结果见图 1。故选择含量测定的检测波长为 258 nm。
        Ⅰ知母总黄酮紫外吸收波谱图  Ⅱ芒果苷的紫外吸收波谱图
        图1 知母总黄酮、芒果苷的最大紫外吸收波谱图
        2.2  对照品溶液的制备取芒果苷适量，于 60℃ 减压干燥至恒重，精密称定，加 70％ 乙醇溶解，制成每毫升含 32 μg 溶液，即得。
        2.3  线性关系实验  精密吸取混合对照品溶液贮备液 1，2，5，10，15，25 ml，分别置于 50 ml 量瓶中，加 70％ 乙醇稀释到刻度，摇匀，即得。分别取上述溶液，进行测定，以溶液浓度与吸收度比值进行回归，分别得到回归方程为：芒果苷：Y= 0.230 9 X-0.003 1（r=0.999 3），表明芒果苷在 0.26～3.57 μg/ml，范围内线性关系良好，芒果苷线性关系见图 2。
        图2 芒果苷线性关系图
        2.4  提取方法的选择
        2.4.1  回流提取法取知母粗粉 1 g，精密称定，置 100 ml 圆底烧瓶中，加甲醇 80 ml，水浴回流提取 3 h，滤过，用少量甲醇洗涤药渣及容器，滤液置于同一 100 ml 量瓶中，放冷，用甲醇补足至刻度，摇匀，取溶液5ml，置于 50 ml 量瓶中，加 70％ 乙醇至刻度，摇匀，作为供试品溶液。
        2.4.2  超声提取法取知母粗粉 1 g，精密称定，置 100 ml 量瓶中，加甲醇至刻度，超声提取 30 min，放冷，用甲醇补足至刻度，摇匀，过滤，取续液 5 ml ，置于 50 ml 量瓶中，加 70％ 乙醇至刻度，摇匀，作为供试品溶液。按“2.3项下分别取上述溶液”起，依法操作，测定各供试品溶液的吸收度。结果见表 1。 表1  不同提取方法对知母总黄酮含量的影响
        表1表明以上两种提取方法差别不大，回流提取法方法繁琐，耗时，能耗大；而且知母含有较多的黏液质，提取液较难过滤。而超声提取法的方法更方便、简单、快速，易于过滤。因此,选择超声提取法提取知母总黄酮。
        2.5  提取溶剂的考察按照上述优选的方法，分别以甲醇和 70％ 乙醇作为提取溶剂，提取知母总黄酮，并进行含量测定，（见表2）。表 2 表明甲醇、70％ 乙醇提取知母总黄酮差别不大，由于甲醇有毒，对环境有污染，选择 70％ 乙醇作为知母总黄酮提取溶剂。表2  不同溶剂对知母总黄酮含量的影响
        2.6  提取时间的考察分别取知母粗粉1 g，精密称定，置于 100 ml 量瓶中，加70％ 乙醇，稀释到刻度，分别超声 20，30，40 min，分别按“2.4.2项下放冷处理”起，依法操作,分别制备供试品溶液，并分别测定（见表3）。表3表明超声 30 min，知母总黄酮含量不再提高，因此，选择超声提取时间为 30 min。
        表3  超声时间对知母总黄酮的影响
        时间t/min吸收度A202.007 6302.138 8402.138 7
        n＝3
        2.7  供试品溶液的制备按照上述优选的工艺参数制备供试品溶液，取知母粗粉1 g，精密称定，置100 ml圆底烧瓶中，加70％乙醇至刻度，超声提取30 min，放冷，用 70％乙醇补足至刻度，摇匀，滤过，取续液5 ml，置于50ml 量瓶中，加70％乙醇至刻度，摇匀，即得供试品溶液。
        2.8  精密度实验取“2.7”项下溶液，在 258 nm 波长下，连续测定 5 次，其吸收度的 RSD=0.09％，表明仪器精密度良好。
        2.9  样品溶液稳定性考查 取“2.7”项下溶液，每隔 2 h 测定1次，测定5次，其吸收度的 RSD=0.09％，表明溶液稳定性良好。
        2.10  重现性实验取同一批的知母粉末5份，分别按“2.7”项下制备样品溶液，并按样品测定方法，测定5次，芒果苷含量9.57 mg/g， RSD=1.72%，表明样品重现性良好。
        2.11  加样回收率实验 取已知含量的供试品5份，分别精密加芒果苷一定量，依法制备供试品溶液，照含量测定法测定，加样回收率为101.01％，相对标准偏差1.27%。结果见表4。表4  芒果苷回收率实验
        2.12  样品的测定按上述方法，对3个不同产地知母药材进行了总黄酮的含量测定。结果见表5。表5  不同知母总黄酮的含量测定
        从表 2 可以看出，不同的产地知母总黄酮含量有较大的差异，其功效也必然有一定的差别，河北知母是道地药材，其功效差别是由于内在的化学成分引起的，通过该实验，证实了河北知母的有效成分含量较高。
       3  讨论
        在研究知母总黄酮含量测定方法时，最初选用芦丁为对照品，但实验结果并不好，而且未见文献报道知母中含有芦丁。由于知母中黄酮类成分较多，同时芒果苷是知母中含量较高的一种黄酮类化合物，且芒果苷紫外吸收波谱图和知母总黄酮的紫外吸收波谱图呈现一致性，因此用其作为知母药材中总黄酮含量测定的对照品更有意义，同时也更能真实反应总黄酮的含量。在知母总黄酮和芒果苷最大紫外吸收波谱图，二者最大吸收波长分别在240，258 nm 呈一致性。原则上，二者均可作为知母总黄酮最大吸收波长，但是由于波长越长，其他杂质干扰就越小，故本次最大吸收波长选定为 258 nm。在知母总黄酮的提取方法上，还考察了以甲醇为溶剂，索氏提取知母总黄酮，结果其提取效果和超声提取相差不大，但是其耗时、方法也很繁琐。因此，所选定的知母总黄酮的提取方法具有简便、快速、准确，可以作为知母总黄酮的提取方法及含量测定方法。
       【参考文献】
         ［1］ 中国药典委员会.中国药典，Ⅰ部［S］.北京:化学工业出版社,2005：148.
       
       ［2］ 廖洪利,王伟新,赵福胜,等.知母化学成分研究进展［J］.药学实践杂志,2005,23(1):12.
       
       ［3］ 陈万生,李 力,乔传卓,等.不同产地知母中芒果甙、新芒果甙的含量测定［J］.中国中药杂志,2000,25(2):87.
       
       ［4］ 倪梁红,秦民坚.知母资源化学及药理研究进展［J］.中国野生植物资源,2005,24(4):16.
       
       ［5］ 徐冬英,谢崇源,韦衮政.知母的研究进展［J］．广西中医学院学报,1999,16(4):93.
       
       ［6］ 郭亚健,范 莉,王晓强,等.关于NaNO2-Al（NO3）3-NaOH比色法测定总黄酮方法的探讨［J］.药物分析杂志,2002,22(2):97.