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       【关键词】  气相色谱
        摘要：目的：探讨GCMS建立中药特征指纹图谱色谱条件的参数设置。方法：在石菖蒲、广藿香等实例研究的基础上，对溶剂的种类和数量，以及升温程序、电离电压、柱前压与流速、离子源温度、进样口温度等仪器参数进行比较。结果：升温程序、电离电压、柱前压与流速等对特征指纹图谱的影响较大，而离子源温度、进样口温度的影响较小。结论：GCMS建立中药特征指纹图谱方法先进、可靠。建议采用特征指标成分群开展方法学(精密度、稳定性、重现性)的考察，且将相对含量的RSD值定为不得大于5%比较符合实际情况。
        关键词：气相色谱质谱联用；特征指纹图谱；特征指标成分群；色谱条件；方法学
        Study on Chromatographic Conditions of GC-MS Fingerprint of TCM
        WEI Gang
        (Central Laboratory, Frist Affiliated Hospital, Guangzhou University of TCM, Guangzhou 510405, China)
        Abstract:Objective:To discuss the Chromatographic conditions of GCMS fingerprint of TCM.Methods:Base of the GCMS analysis of Acorus tatarinowii and Herba pogostemonis, to compare the kinds of the main chromatographic conditions.Results:The main influence factors include the temperature raising process, the detector volts, the column pressure and the column flow. The influence of the injector temperature and the interface temperature are unconspicuous.Conclusion:GCMS fingerprint is a feasible method of TCM. A group of characteristic components should use for estimate the analysis method, and the RSD of precision and reproducibility and stability should be in the range of 5%.
        Key words:GCMS;Characteristic fingerprint;Characteristic components;Chromatographic conditions;Methodology
        中药指纹图谱的研究业已成为中药现代化的关键技术之一。随着色谱联用技术的高速发展，气相色谱质谱联用（GCMS）等技术也加快了在中药指纹图谱研究中的应用步伐。一方面GCMS已广泛应用于单味药材挥发油的成分分析，大多数含挥发油的中药材其主要化学成分已基本搞清，为中药材及复方制剂挥发油指纹图谱的研究积累了丰富的数据；但另一方面必须看到，多数单味中药材挥发油的GCMS分析，仅针对少量的样品，有些甚至仅为一个产地的一个批次，代表性、说服力明显不够，同时有关GCMS方法学的研究报道更是空白。近年来笔者在对大量中药材及复方制剂挥发油成分分析的基础上［1～6］，有意识采用GCMS尝试建立单味药材及复方制剂挥发油的指纹图谱［1，7～9］，并深入开展了方法学的探讨［10］，我们依据GCMS仪器本身的特点，针对气相色谱条件、质谱条件给指纹图谱带来的影响展开了系统的方法学研究，现就有关事项简述如下。
           1供试品的制备
        1.1溶剂中药挥发油一般可选用乙醚、乙醇溶解供分析用。采用水蒸气蒸馏法提取的挥发油可用乙醚萃取后进样，如果乙醚量过大，可置于通风橱内室温适量挥干至1～2 ml，避免高温处理使低沸点的组分随之挥发；若已得到挥发油纯品，可选用乙醇溶解后进样。值得引起注意的是笔者遇到用石油醚萃取的样品，因石油醚的组分复杂，给样品本身组分的鉴别带来极大困扰，因此建议尽量不用石油醚溶解。此外，也曾遇到肉桂油中的肉桂醛在加入甲醇后，少量转化为肉桂酸和肉桂酸酯，且随着时间延长而增多，建议遇到有关含醛类成分引起注意。
        1.2溶剂量我们的研究表明，15～20倍的溶剂量比较理想［7］。即挥发油样品1.0 ml加入15～20 ml溶剂可使分离效果满意。
           2色谱条件
        2.1升温程序研究表明在CGMS色谱条件中，升温程序对挥发油组分的分离效果影响非常明显，应在多批次样品考察的基础上予以制订，笔者在比较过6批次石菖蒲挥发油的分离效果才最终确定石菖蒲挥发油的升温程序［7］。其次我们认为一个理想的GCMS指纹图谱，应该在至少2个不同的升温条件下予以确认，不同的升温条件可导致成分的出峰时间、峰面积有所差异，若在2个升温条件下能得到相同的结果，则可提高结果的可靠性、可操作性［9］。另外，一般来讲升温程序应尽量选择线形升温，如石菖蒲、砂仁 ，但一些样品如檀香的组分分离时间过长，因而选用阶梯式升温模式［11］。中药挥发油的线性升温程序一般可考虑3，4，5，10℃・min1等参数，当组分出峰完全后，可采用15～20℃・min1等参数快速升至250～280℃，并保持数分钟，使柱子里的残余物出尽。
        2.2电离电压电离电压对组分分离效果的影响也非常明显，笔者曾对1.0，1.2，1.4，1.6，1.8，2.0 kV 6种不同分离电压比较［7］，结果显示：电离电压在1.0～1.6 kV时γ细辛醚、β细辛醚、α细辛醚等主要成份相对含量稳定；在1.8～2.0 kV β细辛醚相对含量则明显降低，估计由于离子浓度过强引起积分不完全导致。在大量样品分析的基础上，我们认为一般中药挥发油分析的电离电压可选择在1.2～1.6 kV之间，并根据仪器本身调谐的结果来决定。
        2.3柱前压与流速 柱前压与流速对组分分离效果的影响非常明显。柱前压的不同导致载气流速的不同，从而引起成分出峰时间的改变。4种柱前压120，100，80，60 kPa 对应的流速分别为2.0，1.6，1.3，1.0 ml・min1。研究中可比较以上几种常用柱前压对组分的分离效果再做取舍。
        2.4分流比分流比对组分分离效果有影响。在挥发油样品稀释15～20倍的情况下，分流比可选择10～30∶1。某些样品由于数量少，或浓度稀，分流比可为3～5∶1，甚至不分流。
        2.5接口温度(离子源温度)接口温度对分离效果影响较小。可比较3种不同接口温度200，230，250℃下的组分分离进行取舍。笔者一般选用230℃。
        2.6进样口温度进样口温度对分离效果影响较小。曾对3种不同进样口温度200，230，250℃下进行比较，主成分相对含量几无差别［7］，考虑到进样口温度比样品分析最高温度约高20℃，确定以250℃为宜。
           3方法学考察
       
一般含量测定的方法学考察仅针对某个特定的成分，但在指纹图谱中却是一组成分，笔者在大量分析实践的基础上提出了特征成分群的概念［10］。特征指标成分群：是指能体现该中药(或复方)特征(或独特地貌)的一群成分(几个或十几个)的组合，其核心内涵是指标成分群的相对含量能保持相对稳定，这种集合的稳定性就体现一个中药品种内在质量的稳定性。因此方法学的考察需针对特征指标成分群进行验证，如石菖蒲油中有6个［7］，广藿香油中有11个［9］。
        3.12 h记录图在3～10℃・min1的升温范围内，中药挥发油组分在60 min内基本出峰完全。
        3.2精密度实验取挥发油样品进样分析，连续进样5次，计算相对标准偏差RSD，并按规定其峰面积比值的RSD不得大于3%［12］。我们的分析实践表明对含有众多组分的挥发油来说，选择适宜的对照品或内标物作为参照物［12］，不是一个好的选择，即不易找，也好比画蛇添足。挥发油本身组分的相对含量已经是一个相对的质量分数比值(与仪器可检测出成分的总量相比)，其本身相对含量的稳定更能体现中药内在质量的稳定。研究结果表明：石菖蒲6个指标成分保留时间的相对标准偏差均小于0.2%，相对含量除γ细辛醚的相对标准偏差为7.1%外，其余均小于5%，提示精密度良好［7］；广藿香11个指标成分群保留时间变异系数均小于0.1%，相对含量除β广藿香烯变异系数为8.77%外，其余均小于5%，提示仪器精密度良好［9］，以上结果表明相对含量可以直接用于精密度的计算，并建议将RSD值改定为不得大于5%为宜。
        3.3稳定性实验取挥发油样品进样分析，分别在不同时间检测(1，2，3，6，24，48 h等)，计算特征指标成分群相对含量的RSD值，建议RSD值不得大于5%。以上建议基于如下研究结果：石菖蒲油6个指标成分保留时间的相对标准偏差均小于0.3%，相对含量的相对标准偏差均小于5%，提示120 h内供试品溶液稳定性较好［7］；广藿香11个指标成分群保留时间变异系数均小于0.2%，相对含量除β广藿香烯变异系数为12.96%外，其余均小于5%，提示72 h内供试品溶液稳定性较好［9］。
        3.4重现性实验同一批号的挥发油供试品5份以上，按照供试品的制备和检测方法制备供试品并进行分析，计算特征指标成分群相对含量的RSD值，建议RSD值不得大于5%。以上建议基于如下研究结果：石菖蒲油6个指标成分保留时间的相对标准偏差均小于0.3%，相对含量除γ细辛醚的相对标准偏差为6.3%外，其余均小于5%，提示重现性良好［7］。广藿香油11个指标成分群保留时间变异系数均小于0.3%，相对含量除β广藿香烯变异系数为7.69%外，其余均小于5%，提示重现性良好［9］。
           4讨论
        4.1我们的研究表明在GCMS色谱条件中，升温程序、电离电压、柱前压与流速等参数对挥发油组分的分离效果影响明显，进样口温度以及离子源温度影响较小。尤其是升温程序，应在多批次样品考察的基础上予以制订。在色谱条件的建立上，单味药材与复方挥发油没有区别。
        4.2中药挥发油组分较多，几十以至上百个，而以为数不多的相对含量较大的主要特征性成分作为评价指标考察色谱条件的精密度、稳定性、重现性，是实际可行的选择。由于GCMS常选用石英毛细管色谱柱，在升温程序确定后，挥发油各组分保留时间的变异系数均很小［7，9］，因此组分的相对含量成为更确切的评价指标。
        4.3条件允许应探讨不同色谱柱主流商品(DB1，DB5，DB1MS，SE54，HP5等)对指纹图谱的影响。此外，采用GCMS建立的单味药材以及复方挥发油指纹图谱，可进一步采用气相色谱仪实施验证［13］。采用同样的色谱条件，比较指标成分群出峰时间、相对含量的异同，利于推广。
        4.4一些新手经常不注意色谱柱的老化，使残留物出现在样品图中；甚至有些直接将挥发油注入仪器(不加溶剂)分析，导致样品浓度过浓，无法检测。一般的乙醚、乙醇等溶剂峰在1～2 min内均可出来，因此只要设置好开始出峰时间，就可避免溶剂峰太高导致样品峰的“矮化”现象，同时也保护了检测灯丝。
           参考文献：
        ［1］魏刚.3种中药复方制剂所相色谱/质谱联用鉴别研究［J］.中国中药杂志，2001，26(6)：399401.
        ［2］魏刚，曾经考，黄月纯.GCMS在中药复方制剂挥发油研究中的应用分析［J］.中药新药与临床药理，2000，11(5)：295298.
        ［3］王迎春，林劢，魏刚.阳春砂果实、种子团及果皮挥发油成分分析［J］.中药材，2000，23(8)：462463.
        ［4］魏刚，刘进先，方春亮，等.GCMS追踪筛选加味苍耳子散挥发油提取工艺［J］.中成药，2001，23(2)：8183.
        ［5］丁平，杜景峰，魏刚，等.砂仁与长序砂仁挥发油化学成分的研究［J］.中国药学杂志，2001，36(4)：235237.
        ［6］魏刚，方永奇，吴启端，等.GCMS建立醒神滴鼻液中间产物质量控制标准研究［J］.中成药，2001，23(9)：638641.
        ［7］魏刚，方永奇，刘东辉，等.GCMS建立石菖蒲挥发油特征指纹图谱方法学研究［J］.中国中药杂志，2004，29(8)：764767.
        ［8］魏刚，符红，王淑英，等.GCMS法建立广藿香挥发油指纹特征图谱研究［J］.中成药，2002，24(6)：407410.
        ［9］魏刚，李薇，徐鸿华.GCMS建立石牌广藿香挥发油指纹图谱方法学研究［J］.中成药，2003，25(2)：9195.
        ［10］魏刚.中药GCMS指纹图谱的方法学探讨［J］.中药新药与临床药理，2005，16(1)：7376.
        ［11］林劢，魏敏，肖省娥，等.外界刺激对檀香挥发油含量及质量的影响［J］.中药材，2000，23(3)：152154.
        ［12］国家药品监督管理局.中药注射剂指纹图谱研究的技术要求(暂行)［J］.中成药，2000，22(10)：671673.
        ［13］丁平，曾元儿，何智健，等.不同产地阳春砂挥发油的气相色谱指纹图谱研究［J］.中国药学杂志，2004，39(6)：418420.
        (广州中医药大学第一附属医院实验中心，广东 广州510405)