虎参痛风胶囊对高尿酸血症小鼠T细胞亚群的影响
作者：陈超
《时珍国医国药》 2005年 第8期
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【关键词】 虎参痛
摘要：目的：探讨虎参痛风胶囊(Hus)对高尿酸血症小鼠T淋巴细胞亚群的影响。方法：小鼠按随机化分组原则分为空白组、别嘌呤醇组、模型组及5%，2.5%，1.25%虎参痛风胶囊组，灌胃给药6 d后，采用腹腔注射黄嘌呤一次造模，30 min后摘眼球取血，尿酸酶比色法测定血尿酸；处死小鼠，取脾脏，剪碎后，制备成单细胞悬液，单色法应用流式细胞仪测定CD3＋，CD4＋，CD8＋百分比及CD4＋/CD8＋比值。结果：模型组血尿酸明显升高(与空白组比较，P＜0.05)，而别嘌呤醇组和5%，2.5%，1.25%虎参痛风胶囊组能明显降低血尿酸(与模型组比较，P＜0.05)。应用流式细胞仪检测脾脏T淋巴细胞分型结果显示：模型组、别嘌呤醇组和空白组CD3＋，CD4＋，CD8＋及CD4＋/CD8＋均无显著性差异；且5%虎参痛风胶囊组与模型组、空白组、别嘌呤醇组相比较亦无显著性差异。结论：Hus具有明显的降低高尿酸血症小鼠血尿酸的作用，优于别嘌呤醇。急性高尿酸血症和Hus对脾脏T淋巴细胞亚群无明显影响。
关键词：虎参痛风胶囊；高尿酸血症；T淋巴细胞亚群
Influence in the Subpopulations of T Lymphocytes Administrated Hus in Mice
CHEN Chao
(Dept. of Pharmacology of Three Gorges University, Yichang, Hubei, 443003, China)
Abstract:Objective:To elucidate the influence in the subpopulations of T lymphocyte administrated Hus in mice.Methods:Adopt 10% xanthine i.p. in mice to duplicate hyperuricemia model,and administrate drugs for 6 days beforehand. Then, to detect serum urate concentration by uricase chromatometry, and to measure the percentage of CD3＋、CD4＋、CD8＋and CD4＋/CD8＋ ratio of spleen T lymphocytes by monochromic flow cytometry (FCM).Results:5%,2.5%,1.25% Hus group and allopurinol group had significant differentiation respectively compared with model group (P＜0.01，n=8), and were lower than the model group, respectively.And 5%,2.5% Hus group had significant differentiation respectively compared with allopurinol group. It denoted that different dosage Hus can respectively reduce serum urine content in hyperuricemia of mice as similar as allopurinol, and even be lower than normal level. In contrast, there were no significant differences between allopurinol group, model group and normal group in the percentage of CD3＋、CD4＋、CD8＋ cells and CD4＋/CD8＋ ratio in spleen lymphocytes,nor were there significant differences between normal group ,model group, allopurinol group and 5% Hus group in the percentage of CD3＋、CD4＋、CD8＋ cells or CD4＋/CD8＋ ratio of spleen lymphocytes. Conclusion:Hus can obviously significant influence in spleen T lymphocyte subpopulations
Key words:Hus;Hyperuricemia;T lymphocyte subpopulations
痛风多发于中老年男性，是由于嘌呤代谢障碍引起的代谢性疾病，临床特点为高尿酸血症及关节突发性、反复发作性疼痛、炎症，目前西医治疗多依靠秋水仙碱、别嘌呤醇、消炎痛等药物，抑制尿酸合成，缓解症状，控制病情发展，但副作用大，部分患者难以坚持治疗或因重要脏器的副作用不能应用，以致使患者病情得不到及时控制［1］。最近几年由于国内痛风发病率的上升，学者越来越重视痛风的治疗研究，中医药、中西医结合治疗痛风有了较快的发展，具有疗效好、副作用小的特点。已有学者着手中医药治疗痛风的药理机制、免疫机制的研究，也取得一些成果，对中医药治疗痛风的基础研究具有指导意义，能够给中药客观的评价，从而有利于得到国际上的承认，也有利于筛选治疗痛风有效而安全的药物。
虎参痛风胶囊的主要成分具有祛风利湿、祛痰止咳、清热解毒、活血化瘀等功效；药理学研究表明其主要成分均有改善局部血液循环、抗氧自由基、减轻炎症渗出、促进局部对炎症渗出物的吸收、减轻局部炎症反应引起的粘连、抑制瘢痕组织的形成及促进受损组织的修复等作用，还具有良好的镇痛效应［2，3］。因此，我们进行本实验以了解其抗痛风作用及其对免疫系统的影响。
1实验材料
1.1动物22～25 g的昆明系雄性小鼠，共68只。
1.2动物和试剂虎参痛风胶囊(Hushen Tongfeng Jiaonang,Hus),由三峡大学第一临床学院药剂科提供。黄嘌呤(xanthine,Xan),Sigma公司生产，白色粉末，微溶于水，易溶于有机溶剂。别嘌呤醇 (allopurinol,All)，广东彼迪药业有限公司生产，批号：20010801，白色片剂。尿酸试剂盒，上海科欣生物技术研究所生产。Rat lgG1 PE、Mouse CD3 PE(批号：RM3404)、 Mouse CD4 PE(批号：MCD0804)、 Mouse CD8 PE(批号：RM2504)， CALTAG LABORATORIES生产。
1.3仪器Hitachi7170A全自动生化分析仪，JA2003电子分析天平，上海天平仪器厂生产。EPICSXL型流式细胞仪，美国Beckman Coulter 公司生产。
2方法和结果
2.1虎参痛风胶囊对小鼠高尿酸血症的影响
2.1.1实验方法［4］取48只22～25 g小鼠，随机分为6组，每组8只。A组为正常对照组，B组为模型组，C组为别嘌呤醇组，D组为5%虎参痛风胶囊组，E组为2.5%虎参痛风胶囊组，F组为1.25%虎参痛风胶囊组。B组，C组，D组，E组，F组每天分别以生理盐水、5%虎参痛风胶囊、2.5%虎参痛风胶囊、1.25%虎参痛风胶囊、0.45%别嘌呤醇均按10 ml・kg 1・d 1灌胃给药，共6 d。于末次给药1 h后B组、C组、D组、E组、F组小鼠分别腹腔注射10%黄嘌呤10 ml・kg 1・d 1,30 min后球后取血。
2.1.2血尿酸测定按文献尿酸酶法［5］测定血清尿酸。
2.1.3实验数据采用SPSS软件独立样本的t检验。结果见表1。
表1虎参痛风胶囊对小鼠血尿酸的影响(±s)（略）
2.2虎参痛风胶囊对小鼠脾脏T淋巴细胞亚群的影响
2.2.1实验方法取20只22～25 g小鼠，随机分为4组，每组5只。A组为正常对照组，B组为模型组，C组为别嘌呤醇组，D组为虎参痛风胶囊组。B组，C组，D组每天分别以生理盐水、0.45%别嘌呤醇、5%虎参痛风胶囊均按0.1 ml・(10 g) 1・d 1灌胃给药，共6 d。于末次给药1 h后B组、C组、D组小鼠分别腹腔注射10%黄嘌呤0.1 ml/10 g,30 min后处死小鼠，剖腹取出脾脏，剪碎，研磨成单细胞悬液，200目金属网过筛，用无钙镁的Hank"s液调细胞浓度至1×106/ml，取上述细胞悬液100 μl分别加于1～4号试管(标记试管号1#Rat lgG1 PE、2#mCD3 PE、3#mCD4 PE、4#mCD8 PE)管底，取相应的荧光单抗与上述试管的单细胞悬液充分混匀，避光室温孵育15 min，于Coutler PREP破碎红细胞后，上流式细胞仪检测。
2.2.2实验数据采用SPSS软行单因素方差分析。结果见表2。
表2虎参痛风胶囊对高尿酸血症小鼠T细胞亚群的影响(±s)（略）
2.3结果实验表明，模型组血尿酸含量显著高于正常对照组(P＜0.01，n=8)，说明10%黄嘌呤腹腔注射的方法已成功制作出小鼠的高尿酸血症模型。5%虎参痛风胶囊组、2.5%虎参痛风胶囊组、1.25%虎参痛风胶囊组和别嘌呤醇组与模型组比较血尿酸含量有显著差异，均低于模型组(P＜0.01，n=8)。而5%虎参痛风胶囊组、2.5%虎参痛风胶囊组与别嘌呤醇组比较血尿酸含量也有显著性差异。说明不同浓度虎参痛风胶囊和别嘌呤醇一样均能降低痛风小鼠的血尿酸含量，甚至可降低到正常水平以下。进一步表明了虎参痛风胶囊具有良好的抗痛风作用并随着剂量的增加，用药时间延长效果更好。应用流式细胞仪检测模型组和空白组脾脏T淋巴细胞分型结果显示：CD3＋，CD4＋，CD8＋及CD4＋/CD8＋均无显著性差异；且5%虎参痛风胶囊组与模型组、空白组、别嘌呤醇组相比较亦无显著性差异。表明急性高尿酸血症和虎参痛风胶囊对脾脏T淋巴细胞亚群无明显影响。
3讨论
高尿酸血症是痛风发生、发展的重要因素，也是痛风迁延不愈的重要因素之一。本实验应用10%黄嘌呤腹腔注射成功复制出小鼠高尿酸血症模型，即模型组与空白组比较血尿酸含量有显著升高(P＜0.01，n=8)。且5%，2.5%，1.25%虎参痛风胶囊治疗组和别嘌呤醇治疗组与模型组比较血尿酸含量有显著性差异(P＜0.01，n=8)，均低于模型组。而5%虎参痛风胶囊组、2.5%虎参痛风胶囊组和别嘌呤醇组比较血尿酸含量也有显著性差异。说明不同浓度虎参痛风胶囊和别嘌呤醇一样均能降低痛风小鼠的血尿酸含量，甚至可降低到正常水平以下。故虎参痛风胶囊具有明显的降低血尿酸作用，从而减轻高尿酸血症，减少高尿酸血症引起痛风的发作，血尿酸甚至减低到正常水平，表明其良好的抗痛风作用，同时血尿酸降低到正常和接近正常水平，能杜绝高尿酸血症引起的一系列代谢紊乱，如高脂血症、糖耐量异常等。
全T淋巴细胞、全B淋巴细胞为体液免疫和细胞免疫的主要调节细胞。根据分化抗原不同，可以将T淋巴细胞分成CD4和CD8两个亚群。一般认为CD4具有辅助和诱导功能(Th/i)，CD8亚群具有抑制和细胞毒功能(Ts/c)，CD3则表达全部成熟T淋巴细胞。Th/i和Ts/c二者在体内的平衡，对于稳定和调节免疫系统的生理功能及免疫反应强度起着重要作用，二者的微细平衡决定着免疫反应的发生与否及其发生的类型［6］。当Th/i细胞数量减少，Ts/c细胞数量相对增加时机体呈免疫反应低下。因此，检测T细胞及其亚群，对于研究疾病的免疫学变化和机体的免疫状态，具有重要的参考价值。我们检测了小鼠急性高尿酸血症及虎参痛风胶囊对脾脏T淋巴细胞亚群的影响。结果表明，急性高尿酸血症对脾脏T淋巴细胞亚群无明显影响，这与文献报道［7］(痛风患者外周血的CD4＋4B4＋数量、百分比和CD4/CD8比值分别与正常对照组比较无显著性差异)相一致；虎参痛风胶囊对脾脏T淋巴细胞亚群无明显影响，推测可能有三方面的原因：①虎参痛风胶囊对机体的免疫系统无明显影响，其对痛风的治疗作用不是通过影响免疫系统起作用的，我们的研究证明虎参痛风胶囊对PGF2的合成有抑制作用，故其消除急性痛风性关节炎红肿热痛等症状的机理可能与此有关(另文发表)；②虎参痛风胶囊不影响T淋巴细胞亚群的变化，但可能影响T淋巴细胞的活性，可进一步观察T细胞的活性改变来判断其对T淋巴细胞免疫功能的影响；③多数中药药性温和、起效较慢、服药时间较长，本实验小鼠灌药时间为6 d，时间较短，对免疫系统的影响可能还未产生，可观察较长时间服药对免疫系统的影响。
总之，虎参痛风胶囊能降低血尿酸从而产生对痛风的治疗作用，但对T淋巴细胞免疫系统无明显影响，表明其抗痛风尤其是抗急性痛风性关节炎红肿热痛等症状的机制可能与其抑制PGE2的合成有关，可能不是通过影响T淋巴细胞免疫功能来实现的。而急性高尿酸血症并不影响T淋巴细胞免疫，或者说T淋巴细胞亚群及其参与的免疫反应在急性高尿酸血症发病过程中不起作用。但在慢性尤其是在有靶器官损害的高尿酸血症及急性痛风性关节炎的发病和进展过程中，T淋巴细胞免疫是否参与尚不能确定，亦无文献报道。我们将进一步研究虎参痛风胶囊治疗痛风的机理及痛风发生发展的免疫机理。
参考文献：
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(三峡大学医学院，湖北 宜昌443002)