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       【摘要】 
       目的分析不同产地丹参的遗传背景与遗传关系，为丹参药材的栽培育种提供依据。方法采用RAPD与ISSR标记对4个产地的野生丹参、6个产地的栽培丹参共计50个样本进行分析，利用分析软件计算遗传相似性，建立遗传聚类图。结果DNA标记共检测了102个位点，多态条带比率（P）为95.10%，栽培丹参的P值高于野生丹参；居群的总遗传变异Ht为0.238 9；UPGMA聚类可以将不同来源的丹参很好地区分开来。结论不同产地间的丹参存在丰富的遗传多样性，丹参种质在遗传背景上较为复杂，不同产地的丹参已出现明显的遗传分化，但是与地理分布没有相关性。
       【关键词】  丹参； 遗传关系； DNA标记
       Analysis of Genetic Relationships of Salvia miltiorrhiza from Different Habitats Based on DNA Molecular Markers
       XU Hong， WANG Yanyan，WANG Zhengtao*，HU Zhi-bi
       （Key Laboratory of Standardization of Chinese Medicines of Education，Institute of Chinese Materia Medica, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 201203, China; Shanghai R&D Centre for Standardization of Chinese Medicines，Shanghai, 201203, China）
       Abstract：ObjectiveTo study the genetic background and relationship of Salvia miltiorrhizae from different population, and provide reference for the seed selection and cultivation.MethodsGenetic relationship of total 4 wild populations and 6 cultivated populations of S. miltiorrhizae were investigated by ISSR and RAPD analysis, the genetic identity was analyzed by software Popgene 3.2 and the DNA molecular dendrogram was set up by the software NTSYSpc 2.1. ResultsA total of 102 markers with 95.10% polymorphic loci (P) were scored, and the number of P among cultivation population was higher than that of wild population. The Nei"s gene diversity index (Ht) was 0.238 9, and the dendrogram from the clustering of UPGMA showed the good classification of all populations.ConclusionS. miltiorrhizae from different population shows abundant genetic diversities, and their genetic background are complex. There are obvious genetic differentiations among different S. miltiorrhizae, but the genetic relationships did not show coherent with geographical distribution.
       Key words：Salvia miltiorrhizae;   Genetic relationship;   DNA molecular markers
       
       丹参Salvia miltiorrhiza Bge.为唇形科多年生草本植物，具有活血化瘀、消肿止痛、养心安神等功效，常被用于单方、成药、保健品及化妆品，是我国重要出口大宗药材之一。近年来，随着野生资源的减少，野生丹参已远远不能满足临床用药需求，全国许多地区开始栽培丹参，目前栽培品成为丹参的主要来源。但是由于丹参分布范围广，各栽培地区种源来源不同，以及长期无性繁殖导致的品种退化，给丹参的栽培和育种工作造成困难，同时也严重影响丹参的产量与药材的质量。本研究利用RAPD与ISSR标记对不同产地的野生与栽培丹参的遗传变异进行分析，以期为丹参药材的引种栽培与科学选育提供科学依据。
       1  仪器与材料
       1.1  材料分别收集于我国丹参药材的主产区四川、山东、江苏、陕西、安徽及山西等地的野生和栽培药材，见表1。药材标本现存于上海中医药大学中药研究所，由吴立宏博士鉴定药材原植物学名。
       1.2  仪器与试剂PTC-200型PCR仪（Bio-Rad, USA）；Image Master VDS (Pharmacia Biotech, USA)；PowerPac Basic Power Supply 100-120/220-240V(Bio-Rad, USA)；Nucleic Acid and Protein Analyzer (Beckman, USA)。DNA GenRulerTM DNA Ladder Mix (MBI Fermentas, USA)，CTAB、β-巯基乙醇、Tris、EDTA、琼脂糖均为分析纯；ISSR引物与RAPD引物由上海生工生物技术服务公司合成。
       表1  丹参材料及其来源（略）
       2  方法
       2.1  基因组DNA的提取与纯化参照Rogers的CTAB方法稍加改进提取基因组DNA［1］，并将基因组DNA用小量PCR产物纯化试剂盒(上海华舜生物工程有限公司)进行纯化处理，以除去丹参中影响PCR反应的色素及多酚类的次生代谢产物。
       2.2  PCR-RAPD与PCR-ISSR分析优化的PCR-RAPD反应体系（10 μl）含10×PCR buffer 1 μl，MgCl2 (25 mmol/L)0.8 μl，dNTP mix (10 mmol/L)0.3 μl，RAPD引物1.5 μl（10 pmol/L），Taq DNA polymerase (5U/μl) 0.15 μl，模板溶液1 μl（5～10 ng），ddH2O适量。反应参数：① 94 ℃预变性5 min; ② 94 ℃变性45 s; ③ 36 ℃复性45 s; ④ 72℃延伸2 min; ⑤ 重复②～④步骤共37个循环; ⑥ 72℃保温5 min。优化的PCR-ISSR反应体系（10 μl）含10×PCR buffer 1 μl，MgCl2 (25 mmol/L)0.8 μl，dNTP mix (10 mmol/L)0.3 μl，ISSR引物1.5 μl（10 pmol/L），Taq DNA polymerase (5U/ul) 0.12 μl，模板溶液1 μl（5 ng/μl），ddH2O适量。反应参数：① 94 ℃预变性5 min; ② 94 ℃变性45 s; ③ 52 ℃复性45 s; ④ 72℃延伸2 min; ⑤ 重复②～④步骤共37个循环; ⑥ 72℃保温5 min。PCR扩增结束后，以标准DNA GenRulerTM DNA Ladder Mix为分子量标记，用含有0.1% 溴化乙锭的1.5%琼脂糖凝胶电泳PCR产物，电泳缓冲液为0.5×TBE，在5V/cm稳定电压的条件下，电泳1.5 h，电泳结束后在凝胶成像系统下观察并照相保存DNA指纹图谱。
       2.3  数据统计与分析同一引物PCR扩增产物电泳迁移率一致的条带被认为有同源性，按条带有无分别记录为1（有）或0（无），形成原始的表型数据矩阵用于进一步数据处理。用POPGENE1.31与NTSYS-pc (version 2.1)分子进化软件对遗传变异进行分析，以多态条带比率P（Percentage of polymorphic loci，多态性位点除以总位点数）与基因多样性指数（居群的总遗传变异，Ht）衡量遗传多样性，以遗传距离（Genetic distance）、遗传一致性（genetic identity）与UPGMA（非加权配对算术平均法，unweighted pair group arithmetic averages method）聚类分析进行遗传关系的分析。
       3  结果
       3.1  野生与栽培丹参的遗传多样性丹参10个产地的共计50个样本，用筛选的6个RAPD引物与2个ISSR引物进行PCR扩增，共扩增出102条重复性高、清晰的条带，扩增片段的长度从200 bp至2000 bp，其中多态性条带97条，多态条带比率（P）为95.1%，基因多样性指数Ht为0.238 9。6个产地栽培丹参的P值为85.29%，其中产于安徽亳州（S-AHBZ）的遗传多样性最高，P值为21.57%，产于江苏射阳（S-JSSY）的遗传多样性最低，P值为3.92%；4个产地野生丹参的P值为60.78%，产于陕西（S-SX）的遗传多样性最高，P值为16.67%，产于山东（S-SD）的丹参遗传多样性最低，P值为3.57%（表2）。该结果表明不同产地的丹参供试材料的遗传背景不同，存在丰富的遗传多样性，且多态条带比率与基因多样性指数表现出的变化趋势一致；用RAPD与ISSR进行PCR扩增，可以清晰、有效地分辨出不同居群样本的基因型，其中ISSR引物UBC835与UBC856可以将不同产地的丹参区分鉴别。
       表2  不同产地丹参野生与栽培药材RAPD与ISSR标记的遗传变异（略）
       3.2  不同产地丹参的遗传分化根据POPGENE计算不同产地丹参间Nei无偏遗传距离与遗传一致性见表3。10个产地的丹参间，产自山西运城的丹参（S-SXYC）与来自江苏滨海的丹参（S-JSBH）的遗传距离最小，为0.099 6；而来自山西运城的丹参（S-SXYC）与来自山东的丹参（S-SD）的遗传距离最大，为0.377 7；遗传一致性正好与遗传距离相反，遗传距离最小的两个产地的丹参，遗传一致性表现的最大，S-SXYC与S-JSBH之间的遗传一致性最大，为0.905 2，表明它们之间的亲缘关系最近。江苏3个产地居群的遗传一致性介于0.826 7与0.838 9之间，平均0.833 9；山东3个产地的丹参遗传一致性介于0.689 8与0.808 8之间，平均0.759 7，表明不同产地的丹参间存在明显的遗传分化。
       
       根据遗传距离，采用NTSYSpc2.1中的SHAN，用UPGMA法进行聚类分析（图1），从图中可以看出，利用两种分子标记可以将本实验供试样品完全区别开，10个产地的丹参被划分为3个遗传聚类组，其中安徽亳州（A-AHBZ）、山西运城（S-SXYC）与江苏滨海（S-JSBH）的丹参聚为一组，四川中江（S-SCZJ）、山东（S-SD）与陕西（S-SX）的丹参聚为一组，其余5个产地的丹参聚为一组。从本实验样品聚类分析结果可以看出，地理距离相近的丹参没有聚类在一起，表明遗传分化与地理分布的相关性不显著。
       4  讨论
          
       丹参是一种多年生草本植物，广泛分布于我国的华北、华东、中南、西北及西南的部分省区，由于地理位置和生态环境的差异，不同来源的丹参药材所含有的化学成分含量随产地不同而有明显差异，其中野生丹参的脂溶性成分含量明显高于栽培丹参［2～4］。
       表3  不同产地丹参间Nei无偏遗传距离(左下角)与遗传一致性(右上角)（略）
       图1  聚类分析图（略）
       
       本研究对丹参遗传变异的分析表明，不同产地的野生与栽培的供试丹参样品在DNA水平上也表现出丰富的多态性，丹参种质中存在丰富的变异类型。各产地栽培丹参的遗传多样性表现不尽相同，这可能与各地区的种质来源、栽培历史有一定的关系；野生丹参中，产于山东（S-SD）与山东沂水(S-SDYS)的遗传多样性均低于栽培丹参，陕西（S-SX）与山东平邑(S-SDPY)的两个野生丹参也不是很高，这可能与野生丹参的取样数较少有一定的关系，但本实验结果从一定程度上也反应出野生丹参的遗传多样性不高的特点。
       
       遗传聚类结果显示，不同产地的供试丹参出现了明显的遗传分化，所有样品并没有以地理分布聚类的倾向，地理分布相近的样品并没有聚类在一起，如山东与江苏的几个产地的样品都没有聚集在一起。该结果表明，本实验中丹参样品的聚类结果与样品的地理分布没有直接关系，这可能与丹参药材在栽培时种质来源的不确定性有一定的关系。
       
       丹参的栽培主产区是四川、山东、江苏与安徽等省区，研究结果揭示出不同产区的栽培与野生丹参的种质类型都不同，表明种质可能在各产区药材品质的差异中起到了重要作用，因此今后在发展丹参药材的生产的同时，应积极开展优良种质的筛选和保存工作，提高栽培丹参的品质，以使丹参药材的种质资源得到更加科学的发展和利用。
       【参考文献】
         ［1］ Rogers S O, Bendich A J. Extraction of DNA from plant tissues ［J］. PI Molec Biol Manual，1988, 160: 105.
       
       ［2］ 郭宝林，冯毓秀，赵杨景. 丹参种质资源研究进展 ［J］. 中国中药杂志，2002，27（7）：492.
       
       ［3］ 李 力，娄子洋，陈万生，等．不同产地丹参中3种丹参酮含量变异［J］．第二军医大学学报，2000，2l (8)：753.
       
       ［4］ 王道平，周 欣，梁光义，等．不同产地丹参中有效成分的含量变化［J］．天然产物研究与开发，2005，17 (1)：70.