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       【摘要】 
       目的对巴戟天中微量元素的形态进行分析。方法采用电感耦合等离子体质谱法测定巴戟天中13种元素含量及水煮溶出率，并分析水煎液中9种元素的可溶态与悬浮态、正辛醇水萃取体系中醇溶态与水溶态。结果巴戟天中含量较多元素依次为Mn，Fe，Zn，Pb和Cu等。元素溶出率大小不取决于药材中元素总量。在水煎液9种元素中，Se，Mn和Co以可溶态为主，其余以悬浮态为主；Se，Fe，Pb以及肠液酸度下的Cu，Cd的醇溶态含量较高，其余醇溶态含量较低，酸度对元素Kwo值有影响。电感耦合等离子体质谱(ICPMS)分析法线性好、精密度高、可靠性好。结论 巴戟天含有多种生命元素。元素溶出率主要取决于它在药材中存在形态。水煎液中，元素可溶态与悬浮态分布可能与其存在形态及煎出物特性有关；元素醇溶态与水溶态分布应与元素所结合成分及结合的稳定性有关。
       【关键词】  电感耦合等离子体质谱法； 巴戟天； 微量元素； 形态分析
       Study on Speciation Analysis of Trace Elements in Morinda officinalis
       LUO Shengxu， LI Jinying，HU Guanglin，ZHAI Yan
       (China Institute of Atomic Energy，Beijing 102413，China；College of Material and Chemical Engineering，Hainan University， Haikou 570228，China)
       Abstract：ObjectiveTo aralyze the speciation of trace elements in Morinda officinalis. Methods13 trace elements in the drug material as well as the respective dissolved rates in the decoction were measured by ICPMS. Subspeciation of 9 trace elements in the decoction was also analyzed ，including the soluble state,suspended state,both the nC8H17OH-soluble and water-soluble states in the nC8H17OH -water extraction system. ResultsDifferent kinds of trace elements were found in the Morinda officinalis in which the richest is,in turn，Mn，Fe，Zn，Pb and Cu. The size of the dissolved rate did not depend on the content of trace element in the drug  material.About 9 trace elements in the decoction，Se，Mn and Co  existed  mainly  in the  soluble speciation while the rest 6 ones mainly in the suspended speciation. It  was  found  that the content of Se，Fe，Pb and Cu，Cd under the pH of intestinal juice was relatively higher while the others relatively lower in the nC8H17OH soluble speciation .It proved that Kow value of each trace element is influenced by different pH Values. The ICPMS   analytical methord is highly linear,accurate as well as dependable. ConclusionDifferent kinds of life elements have been found in the Morinda officinalis. The size of the dissolved rate depend on the elemental speciation in the drug material. The distribution of the soluble state and suspended state,is probably related to the elemental speciation and the characteristic of decoction. The distribution of the nC8H17OH-soluble and water-soluble states must be contacted to the components and the stability of with which the elements combine.
       Key words：ICPMS；  Morinda officinalis；  Trace element；  Speciation analysis
       
       中药巴戟天为茜草科植物的根，又名巴戟，具有补肾阳，强筋骨，祛风湿的功效 ［1］。微量元素是中药的重要成分，它们与中药的药性、药效乃至毒副作用都有着密切关系［2］。因为元素的营养、毒理、生物学活性和生物利用率与其存在形态密切相关，因此对元素作用的研究，不但要对元素的总量进行分析，更重要的是对元素的存在形态进行研究［3］。对中药巴戟天中微量元素形态分析的研究未见报道。因此，本研究分析了巴戟天中微量元素初级形态，包括测定药材中多种微量元素含量及其水煎液中元素溶出率，在此基础上，对巴戟天水煎液进行微量元素次级形态分析，区分元素的可溶态和悬浮态，并采用正辛醇-水萃取体系模拟中药水煎液在人体胃、肠中的分配，区分元素的正辛醇溶态和水溶态，测定Kow参数及酸度的影响，以评价元素的亲脂性及生物活性［4］。所得结果为进一步的形态研究及深入探讨巴戟天中微量元素的药理作用机制奠定了基础。
       1  仪器与试药
       1.1  仪器  X Series 型电感耦合等离子体质谱仪（美国热电公司）；SYZB石英亚沸高纯水蒸馏器（江苏金坛富华仪器有限公司）；FA1004N电子天平（上海精密科学仪器厂）；101B型数显式电热恒温干燥箱（上海沪越科学实验仪器厂）；MRG70分装式高压密封消化罐（沈阳森华理化仪器研究所）；DL5B离心机（上海安亭科学仪器厂）；SHY2A双功能水浴恒温振荡器（江苏省大地自动化仪器厂）；0.45 μm滤膜（上海市新亚净化器件厂）。
       1.2  试药 浓硝酸，过氧化氢（30%）均为优级纯；正辛醇，氨水均为分析纯；铬、锰、铁、钴、镍、铜、锌、砷、硒、钼、镉、锡、铅标准溶液MultiElement Tune D，含量均为1 000 μg·g1（Supplied by:Thermo electron corporation.），使用时配制至所需浓度；实验用水为亚沸蒸馏水；灌木枝叶标准物质（GBW07603），购自地质矿产部地球物理地球化学勘查研究所；海南产中药材巴戟天由海南省复康大药房提供。
       2  方法
       2.1  样品制备 
       2.1.1  药材样品预处理  剔除巴戟天药材表面有明显伤痕、虫蛀部分，用刷子去掉灰尘、泥等，自来水冲洗干净后，用蒸馏水、亚沸蒸馏水分别冲洗6～8遍，晾干；用医药纱布包裹好，置于烘箱中，在60℃下烘24 h；取适量烘干药材，用玛瑙研钵磨碎，过14目筛，置于食品袋中密封，保存于干燥器中备用。
       2.1.2  药材样品的消化  准确称量样品0.506 0 g，置于PTFE消化罐中，加入5 ml浓硝酸，盖好于室温下预消化24 h，在通风柜中打开盖子，使棕色气体挥尽，观察到溶液中有白色晶状析出物，加入5 ml双氧水，组装好高压密封消化罐，置入烘箱中，于150℃消化4 h，得到澄清透明消化液，以3%硝酸定容至50.00 ml，并保存于塑料瓶中，用封口胶将塑料瓶口封好，在冰箱中（4℃）保存。按上述同样条件，制备空白样和灌木枝叶标准样。
       2.1.3  水煎液样品的制备  准确称取14目的巴戟天药材样品19.724 0 g置于烧杯中，按药材∶水为1∶10加入亚沸蒸馏水浸泡药材1 h，然后用电炉于220 V电压加热至沸腾，改用75V左右电压保持微沸状态1 h，待煎液稍微冷却后将其转移到250 ml离心管中高速（5 000 r/min）离心5 min，将煎液与药渣分离得首煎液，所余药渣再以亚沸蒸馏水按上述方法制得2次、3次煎液，将3次煎液混合均匀后，以亚沸水将煎液定容至500.00 ml，装入塑料瓶中，滴加2～3滴氯仿，盖上瓶盖并用封口胶封好，在4℃下保存、备用。
       2.2  巴戟天中微量元素含量的测定
       2.2.1  标准曲线的制作  以铬，锰，铁，钴，镍，铜，锌，砷，硒，钼，镉，锡，铅等13种元素，浓度分别为0，10，20，50 μg/L的混合标准系列溶液，按ICPMS仪器的优化工作参数（见表1），测定信号强度，建立各元素的标准工作曲线。
       表1  ICPMS的工作参数（略）
       2.2.2  药材中微量元素含量的测定  取“2.1.2”所制备的药材样品溶液，用电感耦合等离子体质谱法测定铬、锰、铁、钴、镍、铜、锌、砷、硒、钼、镉、锡、铅等13种元素的含量。
       2.2.3  水煎液中微量元素含量的测定  取“2.1.3”所制备水煎液5 ml放入PTFE消化罐中，加入5 ml浓硝酸和5 ml双氧水，然后，组装好高压密封消化罐，置入电热烘箱中，升温到150℃，并保持3 h，消化完毕用3%(V/V)的硝酸定容至50.00 ml，用电感耦合等离子体质谱法测定元素含量。
       2.2.4  水煎液中微量元素的形态分析
       2.2.4.1  可溶态与悬浮态的分离分析  取煎液200 ml，高速离心后将离心液用0.45 μm微孔滤膜(预先用3%的硝酸浸泡)真空抽滤，滤液为可溶态，离心物与滤膜上的残渣为悬浮态。将可溶态加热浓缩并用亚沸水定容到100.00 ml；取5 ml按“2.2.3”的消化方法进行消化，用3%(V/V)的硝酸定容至50.00 ml，用电感耦合等离子体质谱法测定9种元素含量，扣除滤膜空白，即可得到可溶态元素含量，差减法（水煎液中元素含量减去可溶态元素含量）计算悬浮态元素含量。
       2.2.4.2  正辛醇-水分配体系中醇溶态与水溶态的分离分析取水煎液2组各10 ml，用稀释100倍的氨水、硝酸调节溶液pH值，一组调为胃液酸度（ pH=1.3 )，一组调为小肠液酸度（pH=7.60），放置过夜，次日每份每次均加入正辛醇5 ml，在37℃下振荡萃取2 h，共萃取3次，合并3次萃取的水相和醇相，水相按“2.2.3”所述方法消化，定容至50.00 ml，用电感耦合等离子体质谱法测定9种元素含量，扣除空白即可得到水相中元素浓度Cw，差减法算出醇相中元素浓度C0，据此可计算微量元素在醇相与水相中的分布参数Kow=C0/Cw。
       3  结果与讨论
       3.1  巴戟天中微量元素的含量分布及溶出率巴戟天及其水煎液中微量元素的含量、水煮溶出率见表2。可见，在13种元素中，巴戟天含有量较多的是Mn，Fe，Zn，Cu 和Pb，其中Mn（415.5 μg/g）＞Fe（280.4 μg/g）＞Zn（23.86 μg/g）＞Pb（13.99 μg/g）＞Cu（5.210 μg/g）（见图1）。Mn，Fe，Zn，Cu是构成生命体内许多重要酶的组分，是重要的生命元素，应是构成巴戟天药效的基础物质。实验证明，动物缺锰会出现发育迟缓、卵巢和睾丸萎缩、性成熟明显障碍等表现；锌能增强促性腺激素受体分子的生物学活性，缺锌的幼年动物睾丸中睾酮水平下降，缺锌的人循环血睾酮水平下降［5］。巴戟天具有补肾阳的功效可能与其富含锰、锌有关，也可能与锰/锌比具有一定的相关性。值得注意的是，巴戟天含铅量高达13.99 μg/g，其含量超过了我国《药用植物及制剂进出口绿色行业标准》（WM22001）规定的限量指标（Pb≤5.0 μg/g），这可能与巴戟天药材来源于植物的根部，对土壤中铅元素的富集能力较强有关，因此在使用上应注意对巴戟天中铅含量及其溶出率的控制。
       表2  巴戟天及其水煎液中元素的含量和水煎液中元素溶出率（略）
       “-”表示该项未检出
       图1  巴戟天中含量高元素的分布（略）
       图2  巴戟天中含量低元素的分布（略）
       
       巴戟天还含有Ni，Cr，Co，Se，As，Cd，Sn，Mo等微量元素，其含量较低，均小于0.95 μg/g，它们含量分布为Ni＞Cr＞Co＞Se＞As＞Cd＞Sn＞Mo（见图2）。其中As和Cd为有害元素，含量分别为0.240 7μg/g和0.221 1μg/g，它们的含量均没有超过我国《药用植物及制剂进出口绿色行业标准》（WM22001）规定的限量指标（As≤2.0 μg/g，Cd≤0.3 μg/g）。对巴戟天中微量元素含量分布的研究，可为巴戟天药材质量控制和服用安全性提供依据。
       
       从表2中溶出率数据来看，巴戟天中元素溶出率参差不齐。虽然从巴戟天中元素总量与其水煎液中元素含量的分布关系图（见图3）来看，巴戟天水煎液中元素的溶出量与其原药材中元素总量之间存在一定的对应关系，说明原药材中含量高的元素其水煎液中溶出的绝对量也高，但从更能反映各元素溶出特性的溶出率来看，钼的溶出率为最高（74.59%），其次是锰（71.43%）、钴（60.22%）、锌（56.50%）和镍（50.27%），其余元素的溶出率都较低（＜50%），溶出率较高的元素中锰、锌在药材中的总量也较高，但钼的溶出率最高，而其在药材中的总量则是所有被测元素中最低的，钴在药材中总量也不高，这说明药材中元素的溶出率大小并不取决于元素在药材中总量的高低，而应取决于元素在药材中的存在形态。如巴戟天中钼可能以可溶解的钼酸钠、钼酸胺的形式存在，所以其溶出率高。因为不同元素在药材中存在的化学与物理形态不同，水的溶解性不同，其水煮溶出特性和溶出率不同。 因此，研究中药中微量元素的溶出率，认识其溶出特性，反过来可认识中药中元素的存在是否为易于溶出的形态，从而成为中药中元素初级形态的研究内容。此外，中药微量元素溶出率还与中药的煎制工艺有关［2］，由于中药的服用方式是水煎液，因此如何通过改进中药煎制工艺，提高水煎液中必需元素的溶出率，同时降低有害元素的溶出率，以提高中药的服用安全性与药效，是十分有意义的研究课题。
       图3  巴戟天中元素总量与其水煎液中元素含量的分布关系（略）
       3.2   水煎液中微量元素可溶态与悬浮态的分布将水煎液按“2.2.4.1”步骤分离出可溶态和悬浮态，经ICP-MS法测定9种元素含量，结果见表3，同时在表中列出水煎液溶出率。
       
       表3显示，溶出元素在水煎液中的存在形态各不相同。从溶出率与E/F的数据来看，溶出率大的元素，其在水煎液中可溶态比例也较高，但并非严格的相关关系，比如溶出率大于45%的元素中，Se，Mn和Co的E/F>1.9，而Mo，Zn的E/F<0.98，溶出率小于45%的元素，其E/F<0.88。溶出率与E/F数值具有一定联系，这可能是溶出率大的元素，其存在形态往往是可溶性的。但水煎液中煎出元素的实际分布形态可能还与煎出物的特性有关，如煎出物是胶体或具有较强的吸附性，在水煎液的放置过程中可能会聚集成较大的颗粒，而成为悬浮态。由E/F数值可见，在水煎液中，Se，Mn和Co主要以可溶态存在，而Mo，Zn的悬浮态大于可溶态，其原因可能是，Se，Mn和Co主要以无机自由离子的形式被煎出，而Mo，Zn主要以结合有机大分子（如锌的络合物）或易被吸附的无机离子（如钼酸根）形式被煎出，造成Zn、Mn在水煎液放置过程中易形成较大颗粒的悬浮态。因为中草药中的有机物多为大分子高聚物，易形成胶体吸附微量元素形成更大分子而被滤膜截留［6］。可溶态与悬浮态相比，前者可能以自由离子的形式存在，微粒小而易通过滤膜，因此较容易被人体吸收。照此理解，巴戟天水煎液中的Se，Mn和Co可能会发挥较大的药理作用，如［5］Co能促进Zn的吸收，提高Zn的活性；Mn可促进性激素的合成和促进骨骼生长发育；补Se能防治大骨节病等。这些是否与巴戟天具有补肾阳、强筋骨、祛风湿的功效有关联有待深入探讨。值得注意的是，重金属Pb 和Cd悬浮态含量较高，这可能对巴戟天服用的安全性有利，据文献［7］报道，此类元素发生人体中毒主要是以离子态形式起作用, 如果结合其他有机大分子化合物, 其毒性会降低, 甚至于完全没有毒性。
       表3  巴戟天水煎液中可溶态和悬浮态的分布（略）
       3.3  水煎液中微量元素醇溶态与水溶态分布及酸度的影响正辛醇是一种在结构上与人体内的碳水化合物和脂肪类似的长链烷烃醇，药理上药物鉴定常以正辛醇-水萃取体系测定药物的Kow参数以评价亲脂性及生物活性。如果微量元素是中药有效成分，那么正辛醇醇溶态微量元素应具有较强的亲脂性、生物活性，其Kow参数应与中药的药性、药效密切相关。实验中测得不同酸度（胃酸度pH=1.30和肠酸度pH=7.60）下巴戟天水煎液在正辛醇-水萃取体系中醇溶态、水溶态元素含量，计算Kow参数，结果见表4。
       表4  巴戟天水煎液在正辛醇-水萃取体系中醇溶态、水溶态元素含量和Kow（略）
       其中Co，CW分别代表巴戟天水煎液中醇溶态、水溶态元素含量；Kow =CO /CW
        
       可见，在胃、肠液酸度下，其Kow均大于1的元素有硒、铁和铅、铜和镉仅在肠液酸度下Kow才大于1，其余元素的Kow值均小于1。表明在水煎液中，硒、铁和铅具有较高的醇溶态含量，其亲脂性、生物活性较强，同样，铜和镉在肠液酸度下也具有较强的亲脂性、生物活性，而其它元素尤其是钼元素，在胃、肠液酸度下均具有很小的Kow值，其亲脂性、生物活性较弱。元素所表现出的这些差异可能与其结合或络合的有机及无机成分有关，由于结合或络合的成分不同而使元素分子形态不同，导致其Kow值有别。另外，亲脂性、生物活性较强的元素，其药理作用的强弱也许还要受其它因素的影响，如绝对含量高低、起作用的形式等等。比如铅、镉是有害元素，虽然其Kow值较大，但绝对含量低，发生人体中毒主要是以离子态形式起作用［7］，同样不会影响其服用的安全性。
       
       在胃、肠液不同酸度下，除钴、锌和铅外，其它元素的Kow值均随酸度变化而明显不同，不同元素影响程度亦不相同。这可能是酸度变化，使元素结合或络合其它成分的稳定性发生变化，导致其结合的分子形态转变，从而影响其亲脂性、生物活性，使Kow值发生变化。其中，钴、锌和铅的Kow值不随酸度而变化，说明它们在水煎液中的分子形态较稳定，pH不同所引起H+或OH-浓度的变化，并不能改变其结合形态。相反，锰、铜、钼和镉等，其分子结合形态稳定性小，pH改变会破坏其结合形态的平衡，转化成别的分子形态，使Kow值变化大。
       
       综上所述，元素所结合成分不同，其亲脂性、生物活性不同；元素的分子结合形态稳定性小，pH改变对元素结合形态的改变程度大，其Kow值随pH变化大。因此，pH可能是调控中药水煎液中微量元素分子形态的重要因子，可考虑作为中药水煎液的调配指标开展研究，或针对药物作用的不同靶位酸度，研究其有效作用的分子形态，为合理用药提供理论依据。
       3.4  分析方法的精密度和准确度 采用ICPMS所建立的分析方法，标准曲线的线性相关系数为0.999 8～1.000 0之间。该方法测定巴戟天药材中微量元素含量的相对标准偏差为0.1%～5.0%（见表5）。该方法测定国家一级标准物质灌木枝叶（GBW07603）中微量元素含量，除镉外（镉的标准值也是不确定值），回收率在84.9%～123.3%之间（见表6）。由此可见，实验所建立的分析方法线性好，精密度高，可靠性好。
       表5  巴戟天中元素含量测定的相对标准偏差RSD（略）
       4  结论
          
       高压密封消化罐消解巴戟天，能消解样品至澄清透明，是有效的消解方法。以ICP-MS所建立的元素分析方法，线性相关系数为0.999 8～1.000 0， RSD为0.1%～5.0%，该方法对国家一级标准物质灌木枝叶（GBW07603）的测定结果表明，除镉外（镉的标准值也是不确定值），回收率在84.9%～123.3%之间。因此，ICP-MS法是同时测定巴戟天多种微量元素的有效手段。
       表6  标准物质灌木枝叶中元素含量和回收率（略）
       测定值的表达式为±(S/n )
       
       巴戟天含多种生命元素，含量较大微量元素依次为Mn（415.5  μg/g）＞Fe（280.4 μg/g）＞Zn（23.86 μg/g）＞Pb（13.99  μg/g）＞Cu（5.210 μg/g）。巴戟天含铅量高，达13.99μg/g，其含量超过我国《药用植物及制剂进出口绿色行业标准》（WM2-2001）规定的限量指标（Pb≤5.0 μg/g），这可能与作为植物根部的巴戟天对土壤中铅的高富集能力有关，使用中应注意对药材中铅含量的控制。各种元素的溶出率大小并不取决于元素在药材中总量高低，而应取决于元素在药材中的存在形态。
       
       在巴戟天水煎液中， Se，Mn和Co主要以可溶态存在，而Fe，Cu ，Zn，Mo，Cd和Pb以悬浮态为主要存在形式,元素的这种分布可能与其存在形态及煎出物特性有关。从 Kow参数来看，在巴戟天水煎液中，Se，Fe和Pb具有较高的醇溶态含量，Cu和Cd在肠液酸度下醇溶态含量也较高，其余元素Mn，Co，Zn和Mo醇溶态含量较低。在胃、肠液的不同酸度下，除钴、锌和铅外，其它元素的Kow值均受酸度的影响而明显不同，不同元素影响程度有别。元素所表现出的这些差异可能与其结合成分和结合的稳定性有关。
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