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       【摘要】 
       目的建立白芷扩增片段长度多态性（AFLP）反应体系及筛选出扩增条带丰富的引物。方法以12 份白芷为试材,对AFLP 分析过程中包括提取DNA的方法、DNA 的提取质量和浓度、MseⅠ/ EcoRⅠ酶切反应时间等进行了研究，从64对引物中筛选适合白芷的引物。结果改良的CTAB方法提取的DNA质量比较好，建立了一种适于白芷AFLP 银染技术的优化体系：模板DNA 的用量为400 ng ,酶切体系中MseⅠ和EcoRⅠ反应时间为4 h，筛选出了7对适合白芷的引物。以引物E+AGC/M+CAA构建的白芷种质资源的AFLP 指纹图谱,扩增带多,多态性强。结论建立了适用于白芷的AFLP反应体系，并筛选出了适合白芷的引物，为今后利用AFLP标记技术进行白芷鉴定及种质遗传多样性分析提供了标准化程序。
       【关键词】  扩增片段长度多态性反应体系; 白芷
       Establishment and Optimization of AFLP Analysis System in Angelica dahuruica
       CHEN Yaozhen，    GUO Dingding，  MA Yuying，  CHEN Wen,WANG Xiaodong,TANG Lin*  
       （College of Life Science, Sichuan University, Chengdu,Sichuan, 610064;Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu, Sichuan, 610075）
       Abstract：ObjectiveTo establish an optimized AFLP(amplified fragment length polymorphism) analysis system of Angelica dahuruica.MethodsThe optimized AFLP analysis system was established with 12 Angelica dahuruica from different habitats after a comparative study of the essential factors which influenced the results of AFLP method. ResultsThe improved CTAB conventional method was better to AFLP than SDS method. The results of the  analysis system showed that 1)the dosage of template DNA was 400ng; 2) the time of digest system was 4h; 3) the products of preamplification should be diluted to 10 times; 4)seven pairs of primer(E+AGC/M+CAA,E+ACT/M+CAC,E+AGC/M+CAC,E+AAC/M+CAC,E+ACC/M+CAC,E+AAC/M+CAG,E+ACC/M+CTC)were selected from 64 pairs by screening repeatedly. And E+AGC/ M+CAA could amplify more uniform and high sharp bands. ConclusionOur study showed that the AFLP was suitable for genetic diversification,variety identification,construction of molecular map , identification and classification. These results provide fundamentals for further molecular studies of Angelica dahuruica using AFLP marker.
       Key words：AFLP system;  Angelica dahuruica
       
       扩增片段长度多态性（amplified fragment length polymorphism, AFLP）技术作为一项分子标记技术，是1992年由荷兰Keygene公司科学家Zabeau Mare和Vos pieter 发明并发展起来的一种选择扩增限制性酶切片段的方法［1］。AFLP是基于RFLP ( Restriction Fragment Length Polymorphism) 和PCR(Polymerase Chain Reaction) 相结合的DNA 分析技术。这种方法是一种选择性扩增限制性片段的方法,它结合了RFLP 和RAPD 的优点,既具有前者的可靠性，又具有后者的方便性。现已被广泛应用于生物多样性、指纹图谱构建、遗传图谱构建、基因克隆等诸多领域［2］。
       
       白芷Angelica dahurica为伞形科植物，是一种常用中药，性温，味辛，具有散风除湿、通窍止痛、消肿排脓的功效。目前对白芷的研究主要集中在白芷的品质、化学成分、药理作用等方面，其种质资源多样性、亲缘关系等方面的研究也有一些报道［3，4］，但是运用AFLP技术对白芷基因组的研究还未见报道。因此本研究旨在建立一套适合于白芷的AFLP实验体系，并筛选出多态性强的引物，为进一步研究白芷的遗传多样性、种间亲缘关系AFLP实验奠定基础。
       1  材料与仪器
       1.1  材料白芷，2007-04采自四川遂宁GAP基地白芷种质资源圃。材料原产地见表1。样品经成都中医药大学生药教研室马逾英教授鉴定。取新鲜叶片，用硅胶迅速干燥后带回实验室，储于-70℃冰箱保存。
       表1  供试材料及来源（略）
       1.2  试剂EcoRⅠ，MseⅠ，T4 DNA ligase，rTaq酶，dNTPs购自TaKaRa宝生物工程（大连）有限公司。Mse I／EcoR I接头、Mse I／EcoR I核心引物及Mse I／EcoR I选择性扩增引物由北京赛百盛基因技术有限公司合成。亲和硅烷、剥离硅烷等购于北京鼎国生物技术有限责任公司。甲叉双丙烯酰胺为瑞士进口分装。其他试剂均为国产分析纯。
       1.3  仪器Bio-Rad(MC013208)PCR扩增仪，Gene Genius Bio-imaging System凝胶成像仪，北京六一仪器厂生产的DYCZ-20C型垂直电泳系统。
       2  方法
       2.1  基因组DNA的提取与DNA质量检测采用CTAB 和SDS 法［5,6］ ，并进行改良。取3 μl总DNA进行1%的琼脂糖凝胶电泳，用Gene Genius Bio-imaging System凝胶成像分析系统检测DNA 质量。然后用UV-VIS Spectrophotometer(Tu-1901) 型紫外分光光度仪分别测定其在260 nm，280 nm处的OD值。纯的DNA溶液OD260/OD280应为1.8。OD260/OD280大于1.9时，表明有RNA污染，小于1.6时表明有蛋白质或酚污染［7］ 。合格的DNA浓度等于：OD260×样品稀释倍数×50/1 000。最后统一调整DNA浓度为100 ng·μl-1。
       2.2  白芷AFLP体系的建立AFLP实验流程按邹喻苹［8］ 等的方法进行，并参考他人在其它作物上的反应程序［9，10，15］ 进行优化。
       2.2.1  基因组DNA的限制性酶切本实验选用EcoRⅠ、MseⅠ酶切组合来研究白芷的DNA 多态性水平。于1 500 μl的离心管中加入下列物质：10×NEB2 bufer2 5 μl，样品DNA模板设计5个等次即100，200，300，400，500 ng，MseⅠ(10 U·μl-1) 1.0 μl，EcoR Ｉ(20 U·μl-1) 0.6 μl，10 ×NEB buffer2 5 μl，100BSA 0.5 μl，双蒸水补足体积到50 μl。为了获得白芷基因组DNA双酶切的最佳时间，将反应液混匀后置于37℃分别酶切2，4，6 h后，用1％的琼脂糖凝胶电泳检测，酶切完后65℃温浴10 min钝化限制性内切酶。取出后置于4℃冰箱备用。
       2.2.2   接头连接取40 μl经过酶切的DNA样品，加入EcoR Ｉ接头（30 pm·μl-1）0.3 μl，Mse Ｉ接头（33 pm·μl-1） 2.0 μl，T4DNA ligase(400 U·μl-1) 1.2 μl， T4 ligase buffer 5.0 μl，ddH2O 1.5 μl，总体积为50 μl。16℃连接过夜。一部分稀释10倍作为预扩增模板。稀释好的产物和剩余产物置于-20℃贮存。
       2.2.3   预扩增反应取连接完成的DNA 5 μl，加入EcoR Ｉ预扩增引物（50 pm·μl-1）2.0 μl，Mse Ｉ预扩增引物（50 pm·μl-1）2.0 μl，10×PCR buffer(Mg2+ free) 5.0 μl，MgCl2（25 mmol·L-1）4.0 μl，dNTP（2.5 mmol·L-1）4.0 μl，rTaq酶（5 U·μl-1) 0.5 μl，双蒸水补足体积到50 μl。反应液在离心机上低速短暂混匀。扩增程序如下：94℃ 2 min，94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 1 min，共30个循环；72℃ 5 min；4℃ +∞；反应结束后取5 μl PCR产物用1％的琼脂糖凝胶电泳检测预扩增效果，然后将预扩增产物稀释10～20倍置于-20℃冰箱保存备用。
       2.2.4   选择性扩增选择性扩增反应体系为25 μl。分别取稀释5，10，15，20倍的预扩增产物各3 μl，EcoRＩ选择性引物（50pm·μl-1）1.0 μl，MseＩ选择性引物（50 pm·μl-1）1.0 μl， 10×PCR buffer(Mg2+ free) 2.5 μl，MgCl2（25mmol·L-1）2.0 μl， dNTPs（2.5 mmol·l-1）2.0μl，rTaq酶（5U·μl-1) 0.2 μl，ddH2O 13.3 μl。PCR反应条件：94℃ 2 min，94℃ 30 s，65℃ 30 s，72℃ 1 min ，接下来的12个循环，每个循环降低0.7℃；94℃ 30 s，55.5℃ 30 s，72℃ 1 min 进行23循环；72℃ 5 min；4℃ +∞；反应结束后取5μl用1％的琼脂糖凝胶电泳检测扩增效果，将选择性扩增产物置于-20℃冰箱保存备用。
       2.2.5   聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染参照本实验室已成熟的方法［9］，并稍做修改。取5 μl选择性扩增产物加入3 μl loading buffer混合，95℃变性5 min，立即冰浴，Maker也做同样处理。加样前70W恒功率预电泳45 min，使胶板温度达到40℃以上，然后上样，75W恒功率电泳70 min。固定：电泳结束后，取下胶板，小心分开，把带胶的玻璃板放入10%的2L冰醋酸中固定，放在摇床上低速摇动，30min。用蒸馏水漂洗两次，3 min/次。染色：胶板放入新配置的染色液(2L,2 g AgNO3,3 ml 37%HCHO，2L H2O）中染色30 min。然后用去离子水漂洗10s。显影：胶板转入预冷的显影液(2L,60 g无水碳酸钠，3ml 37%HCHO，400 μl 10mg/ml硫代硫酸钠，2L H2O），轻摇至条带清晰（6～8 min）。终止：用10%的冰醋酸2L定影。最后用蒸馏水漂洗5 min，室温自然风干。
       2.2.6   选择性引物筛选AFLP的引物从64 ( 8 × 8 ) 对AFLP 核心引物组(见表2)依次测试，比较指纹图谱的清晰度与多态性。
       表2  AFLP 选择性扩增引物序列（略）
       
       3  结果
       3.1   模板DNA 的提取对AFLP 而言，模板DNA 的制备是非常重要的一个环节。模板DNA 质量直接关系着实验的成败，因为模板的质量将影响酶切是否充分及以后的连接反应。在实验中提取白芷DNA 采用了CTAB 和SDS 两种方法，基因组DNA在1%琼脂糖凝胶上30min 左右，其结果如图1显示。SDS 法提取的DNA点样孔十分明亮，说明含有较多的杂质，而CTAB 所提DNA无降解，无RNA污染，样品均匀，条带清晰，分子量在2000bp左右，且点样孔周围没有杂质。而且经过测定，CTAB提取的白芷DNA 的OD260/OD280值在1.8左右，SDS法提取的白芷DNA 的OD260/OD280值在1.6 左右。说明经改良CTAB 法所提DNA纯度是很高的，可以用来进行白芷AFLP分析。
       3.2  模板DNA浓度酶切时设计了DNA的量100，200，300，400，500 ng五个梯度，酶切结果如图2，可以看出AFLP 对于DNA 模板的浓度要求并不十分严格，DNA 100 ng，200 ng的酶切产物十分少，其余都获得了较为理想的酶切片段。所以白芷AFLP 分析DNA 模板用量以300～500 ng 为宜(反应体积50 μl) ，太少其产物的量不够，太多则容易导致酶切不充分。考虑到经济的因素，本实验的DNA的量为400 ng。
       
       3.3  酶切时间对酶切反应的影响基因组DNA是否被完全酶切影响最终结果。如果DNA酶切不完全，酶切片段覆盖不了整个基因组，反映的不是真实的多态性［10，11］，难以建立真实的分子指纹图谱。　酶切时间的长短是影响模板DNA 能否酶切充分和完全的一个重要因素，不同种类的植物由于基因组大小不同，酶切时间长短也有差异。本实验用400 ng 的DNA 样品,用MseⅠ(10U)和EcoRⅠ酶(10U)，分别在37 ℃水浴中酶切设计了2，4，6 h 3个梯度，以及MseⅠ、EcoRⅠ单独酶切2 h。 经1 %琼脂糖凝胶电泳后的结果如图3。 2，4，6 h（样品号1，2，3）都可将400ng 的DNA 完全酶切，达到AFLP 分析的要求。序号4为MseⅠ酶切2 h产物，序号5为EcoRⅠ酶切2h产物，作为对照，2 h后EcoRⅠ，MseⅠ都不能把400 ng 的DNA完全酶切，说明样品1、2、3都是双酶切的产物。随着时间的进一步延长，酶切产物的分子量越来越小，浓度也越来越大。由此可见适当增加酶切时间，可提高酶切效果。但是时间过长,势必延长整个实验周期。为了节省时间，确定酶切时间为4 h。双酶切充分后，进行连接，连接电泳图如图4的1～5，可见连接充分，可进行下一步实验。
       图1  DNA琼脂糖凝胶电泳检测（略）
       3.4  预扩增稀释倍数的影响预扩增引物只含1个选择性碱基，选择扩增性能较差，需进一步进行选择性扩增。部分预扩增产物凝胶电泳图如图4的6～10。预扩增反应产物进行稀释后用作选择性扩增反应的模板，稀释5，10，15，20倍的预扩增产物都可以得到比较稳定的选择性扩增条带。虽然AFLP对DNA的浓度要求不严格，但低于1 ×10-12g·μl-1 时得到的AFLP指纹样式往往不可靠［12］。本实验确定预扩增产物的稀释为10倍。
       图2  DNA 双酶切检测（略）
       图3  酶切琼脂糖凝胶电泳检测 （略）
       图4  连接与预扩增产物琼脂糖凝胶电泳图（略）
       3.5  选择性引物的筛选对一个个体的DNA，用64对引物进行扩增，筛选出25对扩增条带丰富，且多态性较好的引物。再用所有个体的混合DNA，用这25对引物进行复筛，得到7对扩增条带丰富、均匀、多态性好的引物见表3。
       表3  筛选出的7对选择性扩增引物（略）
       3.6  聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染聚丙烯酰胺凝胶的制作是个很关键的步骤，首先玻璃板的洗涤一定要干净，其次剥离硅烷与亲和硅烷的涂抹一定要均匀，避免产生气泡。隔夜胶易变干，跑出来的条带会弯曲。染色液与显影液都是现配现用。用E+AGC/ M+CAA选择性扩增后，6%的聚丙烯酰胺凝胶电泳后，银染的结果如图5。可见条带清晰丰富，多态性性强。
       4  讨论
          
       虽然AFLP技术已被广泛应用［13，14］，但由于AFLP实验流程较长、步骤较多，涉及的因素也较多，实验中容易出现一些问题。
       图5  12个白芷个体基因组E+AGC/ M+CAA引物组合选扩结果（略）
       在实验中必须严格按实验流程操作，尤其注意以下几点：①AFLP对DNA的质量要求很高，因而高纯度无污染的DNA是实验成功的先决条件。本实验对SDS法和CTAB法进行了比较，发现SDS法提取的DNA纯度太低，而且DNA样品中0.01%的SDS会使EcoR Ｉ的活性丧失80%以上［15］，因此本实验采用了改良的CTAB法。②对于模板DNA 的浓度, 大多数研究认为AFLP 分析对DNA 的浓度并不敏感［12］，但从我们的研究中发现，还是应注意酶切时DNA 量不能太多，量太多，酶切难以充分，易造成拖带现象，带型模糊，难以辨别；太少时，显带很弱或显不出带来。一般DNA 模板用量以300～500 ng 为宜。③掌握好酶切时间。AFLP 是对酶切DNA 片段进行选择扩增，所以基因组DNA 的充分酶切十分重要，在使用限制性内切酶水解基因组时，一定要彻底。DNA 的酶切完全与否直接影响AFLP 的指纹图谱的质量，当酶切不充分时，将导致出现部分酶切片段。同一DNA 样品在完全酶切和不完全酶切形成的AFLP 指纹大不相同，所以反应的并不是真实的多态性。至少应有80 %的酶切片段在750 bp～100 bp 的范围内,这样才能进入预扩增，否则，难以保证其结果的真实性和可靠性。④PAGE胶的制备中，玻璃板一定要洗干净否则产生气泡影响点样和观察。同时胶的厚薄要均匀，否则条带易倾斜。⑤掌握好染色后漂洗时间和显影时间。
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