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       【摘要】 
       目的从槟榔9种提取物中体外筛选出抗柯萨奇病毒B3，单纯疱疹病毒1型活性成分，从其中3种提取物中体外筛选出抗乙型肝炎病毒的活性成分。方法通过观察药物毒性、病毒引起的细胞病变效应、MTT 法，判断药物毒性及药物抗病毒效应。结果槟榔9种提取物对Hela,Vero细胞具有一定的毒性，而无抗病毒活性，3种提取物不能有效地抑制HepG2.2.15细胞HBeAg的表达。结论槟榔9种提取物体外无抗柯萨奇病毒B3、单纯疱疹病毒1型的作用，3种提取物体外无抗乙型肝炎病毒的作用。
       【关键词】  槟榔； 柯萨奇病毒； 单纯疱疹病毒1型； 乙型肝炎病毒
       
       Investigation on Antiviral Effect of Areca catechu L. Extract in vitro
       WANG Xiaoyan, ZHANG Meiying, WANG Yafeng, HAO Jing, LIU Qiuying, WANG Yifei*, ZHANG Yingjun, YANG Chongren
       (Biomedicine Research and Development Center,Guangzhou Jinan University, Guangzhou 510632, China；State Key Laboratory of Phytochemistry and Plant Resources in West China, Kunming Institute of Botany,Chinese Academy of Sciences , Kunming  650204, China）
       Abstract:ObjectiveTo screen nine extracts of Areca catechu L. for anti-Coxackievirus B3,HSV-1 and three extracts of Areca catechu L. for anti -HBV in vitro.MethodsThe toxic and antiviral effect was evaluated by observing toxic effect , cytopathic effect (CPE) ,MTT  colorimetric assay for vital cell rate.ResultsNine extracts had certain toxic effects on Hela and Vero cells in vitro, but they had no antiviral activities. Three extracts of Areca catechu L. could not inhibit the expression of HepG2.2.15 cell"s HBeAg .ConclusionNine extracts  of Areca catechu L.  have no effect of anti-Coxackievirus B3，HSV-1 and three extracts of Areca catechu L. have no anti-HBV in vitro.
       Key words:Areca catechu L.;  Coxsackievirus B3 (CVB3);  HSV-1;  HBV
       
       槟榔为棕榈科植物，临床常用其干燥成熟种子。长期的临床实践证明,槟榔具有健胃消食、行气利水、杀虫泻下、利湿除疸的功效［1］。本实验以柯萨奇病毒B3感染Hela细胞，单纯疱疹病毒1型感染Vero细胞和HepG2.2.15细胞，以槟榔的鲜花、果实、花苞不同部位的9种提取物体外抗柯萨奇病毒B3、单纯疱疹病毒1型和其中花苞的3种提取物体外抗乙型肝炎病毒进行了研究。
       1  材料与仪器
       1.1  药物槟榔9种提取物由中国科学院昆明植物研究所提供。植物样品（100 g）， 粉碎，醋酸乙酯提取 ，甲醇提取，热水提取，依次得到醋酸乙酯提取物、甲醇提取物和水提物。醋酸乙酯提取物、甲醇提取物用二甲基亚砜（DMSO）溶解1 mg/ml，水提物用水溶解高压灭菌1 mg/ml。
       1.2  细胞Hela细胞株、Vero细胞株引自美国ATCC。细胞生长液为含10 %新生小牛血清的DMEM ,细胞维持液为含2%新生牛血清的DMEM,常规加入青霉素100 U·ml - 1，链霉素100 U ·ml - 1。2.2.15 细胞HBV DNA 经克隆转染入肝癌细胞(HepG2) 的2.2.15细胞系, 由武汉大学医学院病毒研究所提供。
       1.3  病毒柯萨奇B3 病毒(CVB3 )由武汉大学医学院病毒研究所提供。病毒在HepG-2 细胞中活化增殖后, 其滴度为10- 9 TCID50·ml-1,实验用100 TCID50·ml-1。单纯疱疹病毒1型（HSV-1）由武汉大学医学院病毒研究所提供。病毒在Vero细胞中活化增殖后, 其滴度为10-9 TCID50·ml-1,实验用100 TCID50·ml-1。
       1.4  试剂及仪器DMEM培养基(Hyclone公司) ;病毒唑(利巴韦林注射液,Ribavirin injection广州市市桥药业有限公司) ; 无环鸟苷(ACV)购于湖北科益药业股份有限公司;CO2 培养箱(日本Sanyo公司) ;超净工作台(苏州净化设备公司) ;相差显微镜(德国Laica公司) ;酶标仪(美国BIO - RAD公司) 。MTT（四甲基偶氮唑蓝）为Sigma 公司产品。
       2  方法
       2.1  抗CVB3实验
       2.1.1  药物毒性实验在96孔培养板上加入2.0 ×105/ml浓度的Hela细胞，100 μl/孔，培养24 h，待其生长为单层细胞，弃去培养液，将槟榔9种不同提取物用维持液配制成不同浓度的药液，加入到细胞中，每个浓度设4个复孔，同时设正常细胞对照组、阳性对照组，置37℃，5％CO2 培养箱里培养48 h，其间置倒置显微镜下观察，观察药物的最大无毒浓度。
       2.1.2  药物药效学实验（CPE法）在96孔培养板上加入2.0 ×105 /ml浓度的Hela细胞，100 μl/孔，培养24 h，待其生长为单层细胞，弃去培养液，不同稀释度的药物和病毒各50 μl混合后直接加到单层Hela细胞上，每个浓度设4个复孔，同时设正常细胞对照组、病毒对照组、阳性药物对照组，置37℃，5％CO2 培养箱里培养24～36 h，其间置倒置显微镜下观察CPE。待病毒对照组的细胞病变达到75%及以上时，观察并记录各样品各浓度的细胞病变情况，用MTT法检测细胞的活性。
       2.2  抗HSV-1实验
       2.2.1  药物毒性实验在96孔培养板上加入2.0 ×105 /ml浓度的Vero细胞，100 μl/孔，培养24 h，待其生长为单层细胞，弃去培养液，将槟榔9种不同提取物用维持液配成的不同的浓度，加入到细胞中，每个浓度设4个复孔，同时设正常细胞对照组、阳性对照组，置37℃，5％CO2 培养箱里培养48 h，其间置倒置显微镜下观察，观察药物的最大无毒浓度。
       2.2.2  药物药效学实验（CPE法）在96孔培养板上加入2.0 ×105 /ml浓度的Vero细胞，100 μl/孔,待细胞长成单层后弃生长液, 弃去培养液，不同稀释度的药物和病毒各50 μl混合后直接加到单层Vero细胞上，每个稀释度设4个复孔,同时设病毒对照组、正常细胞对照组、阳性对照组，置5％CO2孵箱中37℃培养，每天观察细胞病变的情况。待病毒对照组的细胞病变达到75%及以上时，观察并记录各样品各浓度的细胞病变情况，用MTT法检测细胞的活性。
       2.3  抗乙型肝炎病毒实验
       2.3.1  细胞毒性检测将生长良好的HepG2.2.15细胞消化后，配制成2×105/ml细胞悬液，加入96孔板中，培养24 h，待其生长为单层细胞，弃去培养液，将槟榔3种不同提取物用维持液配成的不同的浓度，加入到细胞中，每个浓度设4个复孔，置37℃，5％CO2 培养箱里培养48 h，其间置倒置显微镜下观察，观察药物的最大无毒浓度。
       2.3.2  HBeAg 的检测采用Abott试剂进行酶联免疫分析（暨南大学第一附属医院华侨医院检测）。将生长良好的2.2.15细胞消化后，配制成2×105/ml细胞悬液，加入96孔板种，培养24 h后弃去原培养液，再加入用维持液配成的各种浓度的药液，槟榔的浓度为200，100，50 μg /ml。每两天换含同浓度药物的培养液1次, 同时收集上清液后进行检测，共收集3次。
       3  结果
       3.1  细胞毒性测定
       3.1.1  Hela细胞的毒性结果见表1。药物的细胞毒性表现为细胞肿胀,增殖缓慢,胞质颗粒增多,折光性差,边界模糊、破碎, 但未见脱落坏死。由表1可以看出槟榔的鲜花和花苞对Hela细胞的毒性比果实对Hela细胞的毒性要小。
       表1  槟榔提取物对Hela细胞的毒性结果（略）
       3.1.2  Vero细胞的毒性结果见表2。由表2可以看出槟榔对Vero细胞的毒性均很小。
       3.1.3  HepG2.2.15细胞的毒性结果3种提取物的最大无毒浓度均是200 μg /ml。
       3.2  抗病毒实验结果
       3.2.1  槟榔9种提取物抗柯萨奇病毒的实验结果CVB3 病毒对照组在Hela细胞上引起的细胞病变发展迅速,24～36 h后细胞固缩,变圆,破裂,很快脱落。而药物组各浓度的细胞形态的变化与病毒对照组细胞形态变化一致。
       3.2.2  槟榔9种提取物抗单纯疱疹病毒1型的实验结果HSV-1病毒对照组在Vero细胞上引起的细胞病变也迅速，36～48 h后细胞被病毒侵噬，拉成网状。而药物组各浓度的细胞形态的变化与病毒对照组细胞形态变化一致。
       3.2.3  槟榔花苞3种不同提取物对HepG2.2.15细胞株HBeAg表达的抑制作用见表3。槟榔花苞3种不同提取物作用HepG2.2.15细胞后，其HBeAg表达量与正常细胞中HBeAg表达量没有差异。
       表2  槟榔提取物对Vero细胞的毒性结果（略）
       表3  药物作用36h后HepG2.2.15细胞培养上清中HBeAg的测定结果（略）
       SML-P2-HB-E1，SML-P2-HB-E2，SML-P2-HB-E3为槟榔花苞3种不同提取物
       4  讨论
          
       柯萨奇病毒（Coxsackjevirus,cv）是小RNA病毒科的肠道病毒属，可引起人类严重的胰腺炎和心肌炎，也是心肌衰竭和扩张性心肌病的重要原因。其中以柯萨奇B3最为多见，它属典型的溶细胞病毒。单纯疱疹病毒1型是DNA病毒，属于疱疹病毒a亚科，是最早发现的人类疱疹病毒，也是最常见的病毒。它能引起许多疾病，包括急性疱疹口腔炎、唇疱疹、角膜结膜炎、甲沟炎、皮肤疱疹性损害、生殖器疱疹、疱疹性脑炎等炎症性疾病［2］。目前临床上对这两种病毒的治疗最有效的药物分别是病毒唑和核苷类药物，但这些药的副作用都很多。因此开发出新的抗病毒药物成为研究病毒药物的热点。而我国是一个中药资源很丰富的国家，本课题的研究目的就是从已经证明有抗病毒活性的南药中筛选出具有抗病毒的活性成分。
       
       槟榔在临床上主要是驱杀肠道寄生虫，对皮肤真菌、流感病毒、幽门螺旋杆菌均有抑制作用；槟榔的主要化学成分是槟榔碱，槟榔碱具有拟胆碱的作用，能兴奋胆碱受体，促进唾液、汗腺分泌，增加肠蠕动，减慢心率，降低血压，滴眼可使瞳孔缩小。有临床资料显示槟榔和别的中药一起使用可以用于治疗急性病毒性肝炎的不同时期［3］，而在本实验中槟榔不能有效的抑制HepG2.2.15细胞HBeAg的表达，这可能与药物之间的配伍有关，也有可能与调节免疫有关。本实验研究了槟榔9种提取物体外抗柯萨奇病毒、单纯疱疹病毒1型的实验和其中3种提取物体外抗乙型肝炎病毒的实验。结果发现这9种提取物体外无抗柯萨奇病毒、单纯疱疹病毒1型的作用，且其中3种提取物体外无抗乙型肝炎病毒的作用。
       【参考文献】
         ［1］ 梁宁霞 槟榔药理作用研究进展［J］.江苏中医药，2004，25（8）：55.
       
       ［2］ Shigeta S,Mori S,Watanabe F,et al.Saneyoshi M.Synthesis and antiherpesvirus activities of 5-alkyl-2-thiopyrimidine nucleoside analogues［J］.Antiviral chemistry & chemotherapy,2002,13(2):67.
       
       ［3］ 马雄飞.中医分期治疗急性病毒性肝炎［J］.河北中医 ,2006,28(4)：268.